本发明专利技术提供了一种水稻遗传密码子优化的OsrAAT基因，相关载体及其制备OsrAAT转基因水稻种子的方法和OsrAAT的分离纯化方法。通过水稻胚乳细胞特异性表达OsrAAT的表达载体来制备OsrAAT转基因水稻种子，并从中分离纯化OsrAAT，所获得OsrAAT的HPLC纯度为97％，收率可达18.89±3.19％，相当于每公斤的粗米可生产0.366g的OsrAAT。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种水稻遗传密码子优化的OsrAAT基因、相关载体及其从转基因水稻种子生产、分离和纯化OsrAAT的方法。
技术介绍
·人α1-抗胰蛋白酶(AAT)，也称为人α 1_蛋白酶抑制剂(α 1-ΡΙ)，是人外周血中最富含丝氨酸的蛋白酶抑制剂。其主要是在肝脏中合成，并在肺中抑制中性粒细胞弹性蛋白酶(Blank、Brantly，1994)。AAT缺乏症是一种与肺气肿和肝脏疾病相关的遗传性疾病(Eriksson, 1996)。静脉注射增加源自血衆的人α1-抗胰蛋白酶(plasma-derived AAT,pAAT)是治疗AAT缺乏症病人唯一可行的临床治疗方法(Heresi和Stoller，2008)。此外，AAT还有许多的治疗用途，如在预防小鼠I型糖尿病、治疗皮肤病(Lewis，Shapiro等，2005 ；Brown, 2006)，并在先天免疫系统中发挥着重要的抗炎作用(许、戴等，2001)。目前，商业化生产的pAAT主要是来自人血浆，其产量受到血液供应的限制，而且人源PAAT具有传播新的或未知病原体的风险，因此确保其安全性显得非常复杂(Karnaukhova,Ophir等,2006)。除此之外，为了满足市场需求,生产重组al_抗胰蛋白酶(rAAT)并具有成本效益的替代方法也不断被开发出来。1983年，大肠杆菌首先被用于生产无活性的rAAT (Bollen等，1983)。之后用大肠杆菌表达系统表过rAAT的最高水平可达到38mg/L(Karnaukhova等,2004)。但是，由于大肠杆菌表达系统缺乏转录后的修饰作用，其表达的rAAT也只能用于实验室研究。作为真核表达系统的酵母可以进行高甘露糖类型的聚糖修饰作用(Cregg, Cereghino等,2000),但这种修饰与人聚糖结构不同。缺失和异常的糖基修饰是妨碍酵母表达系统表达重组多糖蛋白的主要问题。尽管通过分批补料培养酵母来大规模生产rAAT的收率高达到1. 23g/L (Tamer和Chisti，2001)，然而，药代动力学研究表明，酵母生产的rAAT会被迅速地从血液中清除(Casolaro，Fells等，1987)。也有研究用黑曲霉表达rAAT，因为其糖基化模式是更类似于哺乳动物(Maras，van Die等，1999 ；Gerngross 2004 ;Ward, Lin 等，2004 ;Nevalainen, Te' ο 等，2005)。然而，并没有研究这个系统中的聚糖修饰作用，而且50mg/L的表达水平是仍然很低。因此这个系统表达的rAAT也仅限于实验室研究。如小鼠、兔、山羊和绵羊等动物表达系统也成功地表达了 rAAT (Carlson, Rogers等，1989 ；Archibald, McClenaghan 等，1990 ；Massoud, Bischoff 等，1991 ； Wright, Carver等，1991 ；Carver, Wright 等，1992 ；Ziomek, 1998).也从绵羊奶(DalrympIe 和 Garner,1998)和山羊奶(Ziomek，1998)中获得大规模生产的rAAT。尽管从转基因绵羊奶中分离的rAAT纯度达99. 9%，然而在人类体内，痕量的天然绵羊AAT和α1-抗糜蛋白酶便可以诱导一种全身性抗体应答(Spencer, Humphries等,2005)。也有用植物表达系统生产rAAT,包括水稻细胞(Terashima,Murai等，1999)、转基因番爺(Agarwal, Singh等,2008)和叶绿体(Nadai, Bally等，2009)。其中，转基因番茄和叶绿体中rAAT的表达水平分别达到总蛋白质的1. 55%至2%。在水稻细胞中rAAT的产量达到200毫克/升。最近发现，谷物作物的胚乳细胞是很有潜力的可用于生产重组蛋白质的表达系统。水稻胚乳已被用来表达各种重组药物蛋白，如人乳铁蛋白(Suzuki, Kelleher等，2003)、人溶菌酶(Yang, Guo等,2003)、rhIGF-Ι融合和人粒细胞-巨噬细胞群激活因子(Ning, Xie等，2008 ；Xie, Qiu等，2008)。最近，水稻种子成功地应用于大规模生产的重组人血清白蛋白(He，Ning等，2011)。这些研究表明，水稻胚乳是具有成本效益和安全性的药物蛋白质表达平台。尽管使用不同的表达系统来表达rAAT已经取得了进步，然而大规模生产植物源重组人抗胰蛋白酶仍受到表达水平的限制。而且，至今未见有关使用水稻胚乳来大规模生产重组人抗胰蛋白酶的报道，也未见有关从水稻种子中分离纯化重组人抗胰蛋白酶方法的报道
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种水稻遗传密码子优化的重组人抗胰蛋白酶基因，以提高人抗胰蛋白酶基因在水稻种子的表达水平；本专利技术称0srAAT(0ryZasatiVa AAT)基因，具有如SEQ ID NO.1所示的序列。进一步地，本专利技术还提供了含有上述OsrAAT基因的载体，优选水稻胚乳细胞特异性表达载体，更优选具有如图3所示的结构的载体。本专利技术的另一个目的是提供上述载体在制备OsrAAT转基因水稻种子中的应用。本专利技术的另一个目的是提供一种制备OsrAAT转基因水稻种子的方法，包括以下步骤(I)制备具有如SEQ ID NO.1所示序列的OsrAAT基因； (2)构建水稻胚乳细胞特异性表达的OsrAAT表达载体和选择性标记基因载体；(3)将步骤2所获得载体共转化到水稻品种的愈伤再生组织中；(4)培养所述愈伤再生组织，经筛选和诱导获得OsrAAT转基因水稻植株；(5)培养OsrAAT转基因水稻植株，获得OsrAAT转因水稻种子。其中，所述OsrAAT表达载体优选具有如图3所示的结构。其中，所述选择性标记基因载体优选具有如图4所示的结构。本专利技术的再一个目的是提供一种从OsrAAT转基因水稻种子中分离纯化OsrAAT的方法，包括以下步骤(I)以OsrAAT转基因水稻种子为原料制备OsrAAT提取液；(2)以阴离子交换层析对OsrAAT提取液进行初级纯化，获得初级OsrAAT洗脱液，其中所述阴离子交换层析的介质为DEAE sepharose FF;(3)以阳离子交换结合金属螯合的复合层析对初级OsrAAT洗脱液进行中级纯化，获得中级OsrAAT洗脱液,其中所述复合层析的介质为MacroprepCHT-1 ；(4)以阴离子交换结合疏水作用的复合层析对中级OsrAAT洗脱液进行末级纯化，获得纯化的OsrAAT,其中所述复合层析的介质为Capto Adhere。进一步地，上述方法包括以下步骤(I)以OsrAAT转基因水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80-100目的米粉，将所述米粉与提取缓冲液以重量(kg)/体积(L)为1: 5-1 10的比例混合，常温下提取I小时后将得到的混合物经滤布式板框压滤机压滤，得到澄清的OsrAAT提取液；其中所述提取缓冲液的成分为20-25mM磷酸盐缓冲液、l-4mM巯基乙醇，pH6. 9-7.1 ；(2)采用DEAE sepharose FF填料的层析柱进行初级分离纯化,采用8_12个柱体积的PH为6. 9-7.1的20-25mM磷酸盐缓冲液，以10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水稻遗传密码子优化的OsrAAT基因，具有如SEQ?ID?NO.1所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨代常，施倩妮，张莉平，
申请(专利权)人：武汉禾元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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