本发明专利技术公开了一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养基，包括幼苗生长驯化培养基、胚发生愈伤组织诱导培养基、胚继代形成培养基和胚成熟萌发成苗培养基，幼苗生长驯化培养基为：１／２改良ＭＳ＋２０ｇ／Ｌ白糖＋０．７％琼脂；胚发生愈伤组织诱导培养基为：改良ＳＨ＋８～１２ｍｇ／Ｌ?２，４－Ｄ＋０．２～０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋３０ｇ／Ｌ蔗糖＋０．３％ｐｈｙｔａｇｅｌ；胚继代形成培养基为：改良ＳＨ＋２～８ｍｇ／Ｌ?２，４－Ｄ＋０．２～０．５ｍｇ／Ｌ?６－ＢＡ＋５０ｇ／Ｌ蔗糖＋０．３５％ｐｈｙｔａｇｅｌ；胚成熟萌发成苗培养基为：改良ＭＳ＋３０ｇ／Ｌ白糖＋０．７％琼脂。本发明专利技术可有效地克服三叶草高频体胚再生培养中不同品种及基因型障碍问题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率，提高育种效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种豆科牧草的高频体胚再生培养方法，更具体的讲涉及一种克服三 叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，属于植物学领域。
技术介绍
三叶草(Clover)是一种世界性分布与栽培的优良豆科牧草，是温带地区人工草 地建植的首选草种，也是各类观赏性草坪和绿地的主要组分，它在城镇的绿化、美化、果园 林木的固氮培肥地力、道路提坝的水土保持等方面均起着不可替代的重要作用。鉴于三叶 草的重要经济价值，许多发达国家纷纷利用生物技术方法来研究改良三叶草，解决三叶草 生产中存在的问题。三叶草是个异质杂合体，自交不亲和，目前世界各国应用的品种80%以上为综合 品种，品种内基因型差异很大，三叶草一些重要的育种目标很难通过常规育种方法达到，如 三叶草抗旱耐盐、抗病抗虫、提高种子及草产量、固氮能力等都达不到理想的效果，因此近 年来，人们试图通过现代基因工程技术，即通过转基因获得抗性植株来培育三叶草新品种， 提高三叶草对各种生态环境的适应性，但作为这种技术能成功应用的前提条件是三叶草在 其组织培养过程中具有高频体胚再生能力，这一直是一个难以克服的问题。三叶草属植物组织培养再生技术的研究始于20世纪70年代，已有的一些报道表 明，大部分三叶草的组织培养再生率都极低，只有1 %甚至更小，且再生过程较长，一般需 4 6个月左右，再生性和再生频率易受基因型影响，这已经成为限制不同基因型，尤其是 优良品种转基因的瓶颈。Nancy和Jerzy 1989年通过红三叶叶柄愈伤组织的诱导，获得了 70 81%的植株再生率；Quesenberry和Smithl993年报道了红三叶再生技术的研究，大 约有4%的植株再生率比较高，若在这4%再生率高的植株中再进一步筛选和再生，植株的 再生力会提高到70%。三叶草再生体系的建立多是通过器官发生途径，很少有从体细胞胚 胎发生途径建立的报道，更未见有适宜于三叶草基因转化的高频率体细胞胚再生组织培养 技术体系的报道。由于体细胞胚是克隆起源的，体胚发生途径更能保证转基因植物的遗传 一致性(不形成嵌合体)，使外源基因可通过花粉和配子传递给后代。所以，体胚再生技术 是植物组织培养中最有吸引力的方法，被广泛应用于植物遗传转化、体细胞变异系的筛选寸。先前的研究者大多只选择了 1个种的1 3个品种为材料，由于研究的品种数量 少，不具代表性，这些研究均难以解决三叶草不同品种及基因型障碍的问题。因此，建立三 叶草不受品种及基因型限制的高频体胚再生培养体系是获得各类品种三叶草转基因成功 的重要前提。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种可有效提高体细胞胚发生 频率和再生植株频率的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法。本专利技术是通过以下技术方案来实现的一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，包括以下步骤(1)选材三叶草成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后，在幼苗生长驯化培养基上 培养无菌苗，选取萌发后的无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片三种外植体；(2)胚发生愈伤组织诱导将上述选取的外植体接种于胚发生愈伤组织诱导培养 基上，在白天室温27 士 2 °C、夜晚室温20 士 1 °C的条件下暗培养28 30天；(3)胚继代形成培养将上述经胚发生愈伤组织诱导培养后的外植体接种于胚 继代形成培养基上，首先进行5天的4 6°C低温人工气候箱暗培养，然后在白天室温 27 士 2°C、夜晚室温20 士 1 °C的条件下暗培养30-35天；(4)胚成熟萌发成苗培养将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌 发成苗培养基上，在白天室温27士2°C、夜晚20士 1°C、光照强度为1000 15001x的条件下 进行14h/d的光培养20 25天，形成幼苗；(5)壮苗生根培养将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生长驯化 培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；(6)生根的再生植株移栽、成活；所述的幼苗生长驯化培养基为1/2改良MS+20g/L白糖+0. 7%琼脂；所述的胚发生愈伤组织诱导培养基为改良SH+8 12mg/L 2,4-D+O. 2 0. 5mg/ L 6-BA+30g/L 蔗糖+0. 3% phytagel ；所述的胚继代形成培养基为改良SH+2 8mg/L 2,4-D+O. 2 0. 5mg/ L6-BA+50g/L 蔗糖 +0. 35% phytagel ；所述的胚成熟萌发成苗培养基为改良MS+30g/L白糖+0. 7%琼脂。上述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。其中常量营养元素的组分和其对应的浓度如下硫酸铵463mg/L;硝酸钾2830mg/L ；二水氯化钙166mg/L七水硫酸镁185mg/L无水磷酸二氢钾400mg/L乙二胺四乙酸铁钠盐1.4mg/L。微量营养元素的组分和其对应的浓度如下一水硫酸锰10mg/L ；硫酸锌1. Omg/L硼酸5. Omg/L碘化钾1. Omg/L钼酸钠0. lmg/L硫酸铜0. 2mg/L氯化钴0. lmg/L。有机试剂的组分和其对应的浓度如下盐酸硫胺素5. Omg/L ；5烟酸5. Omg/L ；盐酸吡哆醇5. Omg/L。上述的改良MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。其中常量营养元素的组分和其对应的浓度如下硫酸铵1650mg/L;硝酸钾1900mg/L ；七水硫酸镁370mg/L ；无水磷酸二氢钾170mg/L ；二水氯化钙440mg/L ；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L;七水硫酸亚铁27. 8mg/L。微量营养元素的组分和其对应的浓度如下四水硫酸锰22. 3mg/L ；硫酸锌8. 6mg/L ；硼酸6.2mg/L;碘化钾0. 83mg/L ；钼酸钠0. 25mg/L ；硫酸铜0. 025mg/L ；氯化钴0. 025mg/L。有机试剂的组分和其对应的浓度如下盐酸硫胺素1. Omg/L ；烟酸1. Omg/L ；盐酸吡哆醇1. Omg/L ；肌醇100mg/L。本专利技术的有益效果是本专利技术通过选择适宜外植体、改良基本培养基及成分、调整 培养条件等配套措施，有效地克服了三叶草高频体胚再生培养中不同品种及基因型障碍问 题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率。建立三叶草高频体胚再生技术体系是 保证三叶草体细胞诱导变异、高效稳定遗传转化、获得大量可供筛选的目标植株的前提条 件，通过优化简化三叶草体细胞胚胎发生和植株再生培养基和技术体系，能有效的发挥转 基因等生物技术在三叶草现代育种中的作用，提高育种效率。附图说明图1为三叶草外植体在胚发生愈伤组织诱导培养基上培养的胚型细胞；图2为杂三叶在 胚继代形成培养基上发育的体细胞胚；图3为红三叶在胚继代形成培养基上发育的体细胞胚；图4为白三叶在胚继代形成培养基上发育的体细胞胚；图5为体细胞胚在胚成熟萌发成苗培养基上发育成的鱼雷胚；图6为体细胞胚在胚成熟萌发成苗培养基上发育成的子叶胚；图7为鱼雷胚继代培养萌发成的分化小苗；图8为子叶胚继代培养萌发成的分化小苗；图9为鱼雷胚的分化小苗发育成的幼苗；图10为子叶胚的分化小苗发育成的幼苗。具体实施例方式下面将结合附图和具体实施例，详细说明本专利技术的具体实施例方式图1为三叶草外植体在胚发生愈伤组织诱导培养基上培养的胚本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养基，包括：幼苗生长驯化培养基、胚发生愈伤组织诱导培养基、胚继代形成培养基和胚成熟萌发成苗培养基，其特征在于：所述的幼苗生长驯化培养基为：１／２改良ＭＳ＋２０ｇ／Ｌ白糖＋０．７％琼脂；所述的胚发生愈伤组织诱导培养基为：改良ＳＨ＋８～１２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋０．２～０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋３０ｇ／Ｌ蔗糖＋０．３％ｐｈｙｔａｇｅｌ；所述的胚继代形成培养基为：改良ＳＨ＋２～８ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋０．２～０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋５０ｇ／Ｌ蔗糖＋０．３５％ｐｈｙｔａｇｅｌ；所述的胚成熟萌发成苗培养基为：改良ＭＳ＋３０ｇ／Ｌ白糖＋０．７％琼脂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁慧敏，师尚礼，鲍容静，王永平，王小春，汤容娣，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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