【技术实现步骤摘要】
本专利技术是1983年5月19日递交的496186号申请的后续部分。一般地说，本专利技术涉及胚胎植物细胞和组织的培养，更具体地说，本专利技术涉及特别适于维持由离体诱导体细胞组织产生之胚胎的改良培养基以及使用该培养基的方法。人们知道，遗传工程的最新进展使得植物育种者能够避免传统育种技术中固有的作物改良中的耗时太长的问题。然而，因为单细胞和多细胞生物需要以不同的方法去改变全部遗传信息，所以，应用这些技术仍有困难。对于微生物，一种尝试就是在细胞水平上去影响改变，并有把握通过连续的细胞传代使之扩增。对于多细胞生物来说，如植物，在细胞水平上进行遗传操作是较为有利的，然后使之再生并培养成表达新特性的成熟植物。可通过质粒插入以提供特异改变，或通过原生质体融合以进行大批的遗传操作，将外来遗传物质掺入宿主细胞内。使用传统的植物育种技术，用成熟植物作进一步的遗传操作可向具有农业意义的品种掺入新的特性。〔Allard，R.W.，Principles of Plant Breeding，John Wiley and Sons，New York，1960;Simmons，N.W.，Principles of Crop Lmprovement，Langman Group.Ltd.London，1972〕。离体培养植物细胞和组织，须将培养物保持在培养基内，由培养基提供营养并维持存活力。常用组织培养基的例子已有过文献评述〔见Huang，L.和T.Murashige，“Plant Tissue Culture ...
【技术保护点】
一种用于诱导、再生和维持植物体细胞胚胎组织的植物细胞培养基，其特征在于它包括一种含铵离子源的培养基，培养基中还加有选自Ｌ－脯氨酸、Ｌ－丙氨酸、Ｌ－精氨酸、Ｌ－谷氨酰胺、Ｌ－天冬酰胺、Ｌ－丝氨酸、Ｌ－鸟氨酸、Ｌ－谷氨酸及其酰胺、烷基酯和其二肽衍生物的至少一种氨基酸，与没有加氨基酸的培养基所产生的胚胎相比较，所加入的量足以增加所产生体细胞胚胎的数量和质量。
【技术特征摘要】
US 1985-10-22 790.257。一般说来，用植物细胞和组织培养物产生体细胞胚胎发生的方法是已知的，只须稍加改变即可适用于选定的植物品种。(例如见Plant Tissue CultureMethods and Applications in Agriculture，Thorpe编，(1981);该文相关部分列为本文参考文献)。例如苜蓿，在Saunclers和Bingham的Regen S品系中可通过常规方法诱导胚胎发生(见“Production of Altalfa Plants from Callus Tissue”，Crop Sci.，12804-808，1972)。利用紫花苜蓿(Medicago Sativa)的栽培品种Regens，它是从Vernal和Saranac品种杂交的第二周期重复选择中得到的。愈伤组织的产生按下述方法进行;用50%CloroxR对叶柄表面灭菌5分钟，用水洗涤並涂布于无激素的SH培养平板上，该培养基含有Schenk-Hildebrandt培养基(Schenk，R.U.和A.C.Hildebrandt，文献同上，(1972))所含的盐类，维生素及蔗糖。该培养基含有25μMα-亚萘基乙酸、10μM激动素和0.8%(W/V)琼脂(称为维持培养基)。从仍未愈伤化的植物离体组织上分离出在上面形成的愈伤组织，並在维持培养基上反复培养。愈伤组织以3周间隔培养，並使之于27℃在间接光照下生长。于再培养后17-24天，从维持培养基的平板上收集3-9克愈伤组织，並转移至含有50μM2，A-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和5μM激动素(B)的100ml SH溶液内进行诱导。(见Walker，K.A.M.L.wendeln，和E.G.Jaworski，plant sci Lett.1623-30(1979)。将愈伤组织置于500ml摇瓶内于27℃下培养3天，培养是在间接光照下，在100K.P.M.的轨道震动器上进行的。于轻度真空下，在系列柱筛(Fisher Scientific公司)和无菌条件下筛分被诱导的细胞。细胞块通过不锈钢筛沉落或被挤过35目(480μm)並被收集在60目(230μm)筛网上。用SH无激素培养液洗涤留在60目筛网上的细胞，每100ml诱导培养体积用500ml洗涤。真空除去洗涤培养液。称量细胞块的湿重並将细胞悬浮于无激素的SH培养基内，每毫升悬浮150毫克湿重的细胞。将75mg(0.5ml)的悬浮细胞吸至60mm×15mm培养皿中的大约10ml琼脂固体培养基上。另外，如将300mg(2ml)再悬浮细胞移入装在50ml锥形瓶内的8ml无激素的SH液体培养基中，在悬浮培养物中将出现体细胞胚胎发生。胚胎发生培养基含有SH培养基(NH+4等于2.6mM)，还含有3%(W/V)蔗糖，没有激素。无铵离子培养基是以等量的NaH2PO4代替SH中的NH4H2PO+4制成的。25mM NH+4对照培养基由无铵培养基附加12.5mM(NH4)2SO4组成。通过0.2μm滤膜将所有有机和无机还原氮源除菌，然后加至新近高压灭菌过的培养基内。每种处理一般用10个重复平板进行培养。园盘用保护膜包装並保温21天。悬浮液瓶用塑料泡沫塞住并用Saran Wrap 封口，在100rpm的轨道震动器上保温14天。保温于27℃12小时光照下进行，光源为冷白荧光灯管，固体培养物与光源距离为28Cm，悬浮培养物距光源为200Cm。保温后，用放大10倍的立体显微镜计数愈伤组织上的绿色中心，以检测胚胎发生。用放大10倍的标定目测尺测量胚胎大小。用目测观察以确定胚胎形状。在初始培养的第21天将胚胎由氨基酸处理培养基在无菌条件下移入加有25μM赤霉酸和0.25μmα-亚萘基乙酸并用0.8%琼脂固化的半强度无激素的SH培养基内，以使胚胎转化为有根和萌芽轴(第一初级叶)的完整植物。1.在含铵培养基中的体细胞胚胎的发生A.豆科植物的体细胞培养。按上面概述的方法培养豆科的代表性植物-苜蓿组织，(紫花苜蓿，RegenS品种)，並根据本发明在含有2.6mM铵的培养基中检验体细胞发生。所有蛋白质氨基酸的试验浓度为1-100mM。从此初始筛分过程中出现两种反应类型，基于这些结果，进一步用筛分的细胞进行试验。表2为不包括第一反应类型的氨基酸，发现这些氨基酸与SH-对照培养基(2.6mMNH+4)比较对生长有毒性并抑制胚胎发生。这些氨基包含硫和芳香环的，並且大多是分枝链族的。这些氨基酸与SH对照培养基比较，均不刺激胚胎发生，並且都是有毒的，它们的浓度为1或10mM时都抑制生长或引起愈伤组织的褐化。与SH对照比较，初始筛选的第二反应型可刺激胚胎发生或致使胚胎增大(参见表2)。对这些氨基酸作了详细的浓度依赖性研究，结果示于图1中。刺激体细胞胚胎形成的氨基酸中最有效的是脯氨酸，比2.6mMNH+4对照产生约多3倍的胚胎，而效力是25mMNH+4-苜蓿(D)中最适铵浓度的两倍。(见Walker等人的上述文献)。丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸的效力较小，但它们刺激胚胎形成接近25mMNH+4的水平。丝氨酸和天冬酰胺与SH对照比较，其刺激胚胎发生的作用较差，但可增大胚胎体积。表2概括了已发现对苜蓿体细胞胚胎发生有刺激作用的氨基酸和其它氮源。值得注意的是，脯氨酸的酯和酰胺形成，如二肽脯氨酰丙氨酸一样，在刺激胚胎数目和提高质量方面具有很高的活性。有趣的是发现非蛋白氨基酸-鸟氨酸具有活性。表2还原氮源对苜蓿体细胞胚胎发生的影响刺激源铵脯氨酸丙氨酸谷氨酰胺精氨酸天冬酰胺鸟氨酸丝氨酸赖氨酸L-脯氨酰胺L-脯氨酰-L-丙氨酸L-脯氨酸甲基酯使用上述技术，用目测观察胚胎大小以检测胚胎质量。数据列于表3中。表3 还原氮处理对体细胞胚胎大小的影响处理 长度 宽度对照(25mMNH+4) 0.805±0.084 0.383±0.019100mML-脯氨酸 1.143±0.081 0.867±0.04630mML-丙氨酸 1.163±0.090 0.744±0.037100mML-丙氨酸 1.192±0.102 0.833±0.04930mML-精氨酸 1.521±0.142 0.663±0.04830mML-谷氨酰胺 1.342±0.122 0.773±0.0513mML-赖氨酸 1.163±0.096 0.652±0.0393mML-天冬酰胺 0.699±0.062 0.446±0.02710mML-天冬酰胺 1.239±0.102 0.610±0.034根据表2和表3中给出的数据，氨基酸添加物在增加胚胎体积中的效力可按下列顺序排列精氨酸≥谷氨酰胺＞丙氨酸＞脯氨酸＞NH+4。使用上述技术，观察了胚胎向带有根及萌芽轴(第一初级叶)之完整植株的转化，并将结果列表如下表4 体细胞胚胎向苜蓿小植株的转化初始处理 有第一初级叶的植株百分数25mMNH+433.3%+4.2100mML-脯氨酸 54.0%+6.450mML-丙氨酸 63.5%+4.430mML-精氨酸 59.0%+6.230mML-谷氨酰胺 67.0%+3.4根据表4的数据，影响胚胎向小植株转化的添加物的效力顺序是谷氨酰胺＞丙氨酸≥精氨酸＞脯氨酸＞NH+4这些数据间的相互关系表明，胚胎体积是胚胎向小植株转化的一个良好标志，因此也是上述技术产生的胚胎质量的一个良好标志。测定了刺激琼脂固体培养物和液体悬浮培养物中体细胞胚胎发生的氨基酸的最适加入量。这些数据在下列表5和表6中给出表5 向具有2.6mMNH+4的琼脂固体培养物加入氨基酸对苜蓿体细胞胚胎发生的刺激作用来源 %最大刺激 浓度范围 最适浓度(mM) (mM)对照(2.6mMNH+4) 100 - -L-脯氨酸 330 10-300 (100)L-丙氨酸 314 20-150 (75-100)L-谷氨酰胺 175 20-50 (30-40)L-精氨酸 244 5-50 (30-40)L-天冬酰胺 155 0.5-3 (1)L-鸟氨酸 156 1-3 (1-3)L-丝氨酸 160 0.5-2 (1)L-赖氨酸 233 1-10 (3)L-脯氨酰胺 240 30-200 (50-100)L-脯氨酸甲基酯 241 5-25 (10)L-脯氨酰-L-丙氨酸 210 30-200 (50-100)表6 向具有2.6mMNH+4液体悬浮培养物中加入氨基酸对体细胞胚胎发生的刺激作用来源 %最大刺激 浓度范围(mM) 最适浓度(mM)对照(2.6mMNH+4) 100L-脯氨酸 528 100-300 (100)L-丙氨酸 240 25-200 (50)L-谷氨酰胺 243 5-75 (50)L-精氨酸 168 5-75 (50)L-赖氨酸 180 1-10 (3)B.伞形科植物的体细胞培养使伞形科的代表性植物-芹菜(Apium graveolens，Calmario品种)的种子萌发1-2周。用10%Clorox 的溶液将所得籽苗灭菌20分钟。除去子叶或胚轴，将其置于含有25μM2，4-D和5μM苄基腺嘌呤的0.8%琼脂固化的无激素SH培养基上。出现愈伤组织后(3-4周)，将愈伤组织移入含2.5μM2，4-D和0.5μM激动素的SH培养基内。用滤器将热不稳定性添加物除菌并加入热培养基内。如需要时，可用改良的括抹装置取得用于接种的特定量的组织并将其充填至均一体积。随后在加有1μM毒莠定(Picloram)和0.5μM苄基腺嘌呤的SH培养基上再培养愈伤组织。为进行体细胞胚胎生产，将75mg愈伤组织细胞移入含有经过滤膜除菌的添加物的0.8%琼脂固化的无激素SH培养基内，并在培养苜蓿体细胞的同样条件下，24℃保温18到30天。比较了脯氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺等氨基酸处理的胚胎与NH+4对照处理的胚胎。用50mM丙氨酸处理培养物导致比所有其它处理方法有更高的胚胎发生频率，而且比其它方法处理的培养物有更好的子叶、根和初级叶发育。观察到所形成的总胚胎数的顺序如下20-100mM丙氨酸＞50mM脯氨酸＞25mM谷氨酰胺-N＞25mMNH+4虽然用脯氨酸刺激胚胎发生比用谷氨酰胺更好，但后者可导致更好的籽苗样胚胎的发育。铵处理的培养物比所有其它的处理发育得较小而且胚胎数较少。谷氨酸以30mM的量单独加入芹菜再生培养基内时，与25mMNH+4处理的材料相比较，它可刺激芹菜胚胎数目的增加。与NH+4处理的胚胎比较，上述浓度的丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸可促进胚胎向小植株的转化。C.禾本科植物的体细胞培养使用本发明的培养基，进行禾本科的代表性植物-玉米(Zeamays)的体细胞胚胎发生。受精十天后收获玉米的穗并在无菌条件下从中解剖出未成熟的胚胎。将胚胎置于加有3%蔗糖和5μM2，4-D的N-6矿质盐培养基(Chu，C.C.，Wang，C.C.，Sun，C.S.，Hsu，C.，Yin，K.C.，Chu.C.Y.，1975.Establishment of an efficient medium for anther Culture of rice through Comparative experiments on the nitrogen Sources Sci.Sin.16659-688)上保温21天。保温后检定有或没有L-脯氨酸时每个愈伤组织上形成的胚胎团的数目。结果在表7中给出，其中百分反应是287-1165个重复胚胎分离块的胚胎形成的平均频数。表7 L-脯氨酸对玉米胚胎愈伤组织形成的影响脯氨酸浓度(mM) %胚胎愈伤组织形成0 15.86 20.612 20.824 20.2作为涉及禾本科植物体细胞胚胎发生的进一步的实例，是依据本发明的实践增殖水稻品种陆稻(Oryza Sativa)。使陆稻(Oryza Sativa)种子去壳，进行表面消毒并置于加有4%蔗糖、0.26mM色氨酸、5μM2，4-D、1μM激动素、pH6.2，并加有2.5克/升Gelrite作为凝胶形成剂的Murashige和Skoog(MS)盐类培养基上(Murashige，T.和F.Skoog，1962，见上)。15-21天后用解剖显微镜检测单个种子的胚鳞区上的胚胎形成。表8给出了用和不用L-脯...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴维A斯图尔特，史蒂文G斯特里克兰，史蒂文G斯特里克兰，
申请(专利权)人：植物遗传学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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