【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于重组DNA技术。一方面涉及酵母的整合转化，另一方面涉及酵母的定点突变。本专利技术还涉及一些新的DNA序列及一些新的生物体。随着近年来重组DNA技术的发展，人们可以通过各种微生物有目的地生产各种有用的多肽。已经通过微生物生产出许多真核生物的多肽。诸如人生长激素，白细胞干扰素，人胰岛素和人胰岛素原。应用这些已知的技术还将进而生产更多种类的多肽产品。经常用于重组DNA技术的基本因素是质粒，它是存在于许多微生物中的染色体外双链DNA。在微生物中天然产生的质粒经常是以每个细胞多个拷贝存在着。除了天然质粒外，人们还制备了很多人造质粒或杂交载体。但不幸的是，质粒不总是保持在宿主细胞中。在生物繁殖过程或经过几代的生长后，可能失去质粒。因而人们的兴趣就集中在如何将外源DNA引入合适的宿主生物，这种引入的方法具有很大的潜在价值。迄今，工业应用重组DNA技术生产各种多肽时大多使用大肠杆菌作为宿主。然而有时大肠杆菌被证实不适合作为宿主，例如它含有一些毒性致热物质，而当产物多肽药用时必须将其除去。而提纯产品肽的效率则因不同的肽而异。此外，大肠杆菌的分解蛋白活性也可能大大限制一些有用产品的产率。而且一些异种基因在大肠杆菌中的表达产物也以不可溶的形式产生。这种种原因，使人们更希望能找到其它的宿主。特别是期望用真核生物来生产多肽产品。在真核系统如，酵母中生产多肽产品比用大肠杆菌生产重组DNA编码的多肽可能有更大的优越性。与近年来出现的大肠杆菌大规模发酵相比较，用酵母大规模发酵已有几个世纪的历史。酵母可以比细菌高得多的密度生长，而且容易采用连续发酵工艺。美国人Wegner指出...
【技术保护点】
毕赤属酵母定点选择性修饰基因组的方法，修饰是在预先决定的基因组内定点进行的，其方法包括用系列排列的线性ＤＮＡ片段转化毕赤属宿主菌株，该片段包括：一个第一插入的ＤＮＡ片段，一个可选择的标记基因，和一个第二可插入的ＤＮＡ片段，其 中所说第一和第二可插入ＤＮＡ片段均是一个至少约２００个核苷酸片段，它具有与原来的毕赤各种基因组发生修饰的位点的个别部分同质的核苷酸序列；其中所说的第一和第二可插入ＤＮＡ片段在直线ＤＮＡ片段中是一个接一个与原来在毕赤基因组同样的方向排列的；和其中所说的标记基因位于第一和第二可插入ＤＮＡ片段之间。
【技术特征摘要】
US 1985-10-25 791.013书中将更清楚。根据本发明，发展了一种毕赤酵母属基因组定点修饰的方法。用一个线性DNA片段转化酵母。包括在每端插入如宿主基因组的同质序列的可插入DNA序列，每端至少插入200个碱基，再在中间插入一个附加序列例如可选择的标记基因，其间的标记基因及两侧的可插入DNA序列都以高频率被宿主摄取。用该线性DNA转化的结果，生成了修饰的酵母菌株，其中整合点的DNA序列被破坏和/或被去除，而可选择的标记基因及任何其它基因则作为转化用线性DNA片段的部分被整合到宿主酵母的基因组中。以上述方式插入到宿主酵母的基因组的外源DNA，经过宿主几代的生长，稳定的保存着。本发明的实践消除了当作为自我复制的染色体外的外源DNA取代原有一部分或当外源DNA作为环状DNA分子部分整合到基因组时，质粒不稳定导致外源DNA失去的问题。这种环状DNA分子整合导致由于宿主基因组序列直接重复到宿主基因组侧面插入外源DNA序列。由于这种直接重复顺序是进一步重组的底物，所以插入到直接重复序列间的外源DNA是不稳定的。本发明的直接定点基因组修饰使得可以生产缺少特定基因全部或选择部分的突变。通过除去对某种所需突变的基因实质部分，从而排除突变逆转的可能。根据本发明所得的突变菌株是非常稳定的突变。本发明的直接定点基因组修饰与本领域专业人员熟知的体外DNA重组技术一起应用可以准确地修饰各种宿主基因组，例如在宿主基因组上加一个或多个外源基因，改变控制天然基因表达的调节序列，用一个非天然基因代替一个天然基因等等。人们吃惊地发现，在毕赤诱导外源基因表达的甲醇在毕赤第一个醇类氧化酶基因被破坏的毕赤菌株中表达急剧增加。进而又发现，巴斯德毕赤还有第二个醇类氧化酶基因，当菌株的第一醇类氧化酶基因破坏时，这第二个醇氧化酶基因使该菌株仍可在甲醇上生长，只是没有天然的毕赤生长快。图1是质粒PYM I1的内切酶点图。图2表示将质粒PYM I1的一部分插入到毕赤染色体中的H I S4位点。图3是质粒PY J8的内切酶点图。图4是质粒PYM I3a的内切酶点图。图5表示将质粒PYM I3a的一部分插入毕赤染色体的H I S4位点。图6是质粒PBPG1-1的内切酶切点图。图7是质粒PYM I7的内切酶切点图。图8表示将质粒PYM I7的一部分插入毕赤染色体的醇氧化酶位点。图9表示从质粒PSAOH5和PTHBS3组建质粒PYM39。图10表示从质粒PYM39和pPG3.2组建质粒PYM I6。图11表示从质粒PYM I6和PBSAG5 I组建质粒PBSAG I5 I。图12是比图11更详细的质粒PBSAG I5 I内切酶切点图。图13表示将质粒PBSAG I5 I的一部分插入到毕赤染色体的醇氧化酶位点。图14是质粒PYM I12a的内切酶切点图。图15表示将质粒PYM I12a的一部分插入到第二个毕赤醇氧化酶基因(AOX2)的位点。图16是在基于PBR322的质粒pPG4.0和pPG3.0中毕赤插入体的内切酶切点图。图16a所示的插入来自第一个毕赤醇氧化酶基因(AOX1)的位点，而图16b所示插入来自第二个毕赤醇氧化酶(AOX2)位点。图16c表示已知的AOX1基因位点的醇氧化酶(AOX)编码部分(参考图16a)。图17是质粒PYM25的内切酶切点图。图18是质粒PT76H3的内切酶切点图。下面通篇所用的缩写代表的酶如下缩写 内切酶AS ASuⅡB BamH ⅠB Bgl ⅡC Cla ⅠR1EcoR ⅠR5EcoR ⅤH Hind ⅢHp HpaⅠKp HpnⅠNr NruⅠPs PstⅠRV2PvuⅡRs RSa ⅠS Sal ⅠS3Sau3 A ⅠSm Sma ⅠSp Sph ⅠSt Stu ⅠTh Tha ⅠXb Xba ⅠXh Xho Ⅰ在附图中，用于DNA片段切割及连接的内切酶切点用上述缩写表示。本发明提供毕赤属酵母基因组定点修饰的方法，该方法包括用含有第一个可插入DNA片段一个可选择的标记基因和第二个可插入的DNA片段的系列线性排列的DNA片段转化宿主菌株。第一个和第二个可插入DNA片段都至少有约200个核苷酸长，并在天然毕赤基因组修饰点有与该基因组一部分同质的核苷酸顺序。可选择的标记基因应在得到该基因的细胞中表达出可供选择的表现型，诸如，抗生素抗性基因或一个使细胞能合成生长所需营养的生物合成基因。当可选择的标记基因在DNA载体上时，将仅使接受该载体DNA的细胞在选择的生长条件下生长。可选择的标记基因必须在第一和第二可插入DNA片段之间，而可插入DNA片段在用线性DNA片段进行基因组修饰时，二者都必须位于宿主细胞基因组的相同方向。本发明还提供了含有一个第一可插入DNA片段，一个可选择的标记基因和一个第二可插入DNA片段的系列排列的线性DNA片段。第一和第二可插入DNA片段都至少有约200个核苷酸长，而且具有与毕赤属各种基因组DNA的一部分同质的核苷酸序列，这第一与第二可插入DNA片段在基因组中彼此的方向相同。标记基因位于第一和第二可插入DNA片段之间。根据本发明转化毕赤属各种菌株基本因素含有至少三个成分一个第一可插入DNA片段，一个第二可插入DNA片段，和一个可选择的标记基团。第一个和第二个可插入DNA片段都需具有至少约200个核苷酸，可用达200到5，000个核苷酸的片段，为使操作简便，最好用500到2，000个核苷酸的片段。用于第一和第二可插入DNA片段在天然毕赤基因组修饰点有与核基因一部分同质的核苷酸顺序。因此，如果基因组修饰发生在醇氧化酶基因，则所用的第一和第二可插入DNA片段是与醇氧化酶基因的某一部分同质。插入的这两个片段在毕赤基因组的相对方向是一致的。用于实施本发明的转化DNA的三个起码成分是系列排列成线性DNA片段，其中可选择的标记基因位于第一和第二可插入片段之间。可选择的标记基因包括巴斯德毕赤(Pichia Pastris)和酿酒酵母(Saccharomyus cerevisiae)的ARG4基因，巴斯德毕赤和酿酒酵母的HIS4基因，大肠杆菌可易位因子Tn 601的G418磷酸转移酶等，但不限于这些酶。本领域的专业人员也认识到一些合适的两侧序列，即第一和第二可插入DNA片段，可以是从巴斯德毕赤基因组分的基因中得到的，例如醇氧化酶基因(AOX1和AOX2);毕赤具有两个醇氧化酶基因，二羟丙酮合成酶基因(DAS)，精氨基琥珀酸酯裂解酶基因(ARG4)，组氨醇脱氢酶基因(HIS4)等，但不限于这些基因。转化用线性DNA片段还可包括一些其它的DNA序列，如异种基因，即正常情况不存在于基因组发生插入的位点中，而希望能在巴斯德毕赤中表达的任何基因的一部分。一般地说，异种即不是宿主毕赤细胞中固有的。异种基因可任意地与独立控制产生异种基因产物的调节区结合，异种基因可在转化过程破坏基因的调节区影响下在转化细胞中表达。此外，转化用线性DNA片段也可能包括细菌质粒DNA，诸如PBR322或PBR325序列。这些细菌是在体外操作和在含这些DNA顺序的大肠杆菌中扩大生产中应用的一种用于转化的特别有用的形式，线性DNA作为一个封闭的环状质粒，包含一个第一可插入DNA片段，一个第二可插入DNA片段，一个可选择的标记基因，和细菌质粒DNA。这个质粒也可含有如上所述的附加DNA序列。在优选的实施例中，封闭的环状质粒是由两部分组建的，“转化部分”和“细菌部分”。转化部分包括系列排列的第一可插入DNA片段，可选择标记基因和第二可插入DNA片段。其中的第一和第二可插入DNA片段在毕赤基因组中排列方向是相同的。可选择的标记基因位于第一和第二可插入DNA片段之间。细菌部分将第一和第二可插入DNA片段连接，形成一个闭合的环状载体。如上段叙述，制备的闭合环状载体在大肠杆菌中生产大量质粒，然后分离质粒，用合适的限制酶酶解，从细菌部分切下转化部分，这线性的酵母DNA转化部分就可再用于转化毕赤属的各种菌株，从而根据需要修饰了基因组。当然，本领域的专业人员懂得，上述闭合环状质粒的“转化部分”还可含附加DNA序列。例如用于体外操作和在大肠杆菌中扩大生产DNA的细菌顺序，像可选择的标记基因序列一样，也位于第一和第二可插入片段之间。用于转化的各种DNA成分构建时，细菌序列也将根据本发明的基因组修饰方法整合到宿主酵母基因组中。巴斯德毕赤的转化已在转让给飞利蒲石油公司Stroman等人的共同未决申请No666，579中叙述过了。下面也详述了用于巴斯德毕赤转化的试验步骤。(见例1)，可通过酶解细胞壁先得到环状原生质体的方法转化毕赤属酵母菌株。将球状体与转化用DNA混合，在有钙离子和聚乙二醇存在下温育，然后在选择生长培养基中再生细胞壁。转化用DNA包括一个可供选择的标记基因，它使人们可以选择摄取了转化DNA的细胞，因为在所用选择条件下只有转化了的细胞才可以存活和生长。选择条件是与作为转化用DNA一部分的可供选择的标记基因有关的)。当用第一醇类氧化酶基因(AOX Ⅰ)被破坏的毕赤菌株作为表达异种基因的宿主时，令人惊奇的发现，在一些启动子控制下(如AOX Ⅰ或DAS启动子)该宿主中异种基因产物的表达水平比用醇氧化酶完全感受态的宿主时增加几倍。由此观察结果，进而探索这个现象，肯定了增加宿主中异种基因的表达水平包括使该宿主生长在营养限制条件下，该条件下存在有对底物反应强的启动子区，异种基因就在这个底物反应强的启动子区调整之下表达的。根据本发明为增加基因表达所需的营养限制条件可通过控制培养细胞的营养量或突变的方法来提供，突变宿主在一定生长条件下就限制了营养。例如，在强醇氧化酶或二羟丙酮合或酶启动子调控下，要想提高异种基因的表达水平，这两个启动子对培养其中存在的甲醇都有反应，无论在利用甲醇方面有部分缺陷的宿主或在限制甲醇的生长条件下，醇氧化酶完全感受态的宿主都将提供所需的营养限制条件，从而加强了基因的表达。这里所述加强异种基因产物表达的方法是用于其启动子与营养限制相呼应的任何生物的一般方法。因此，通过将一个异种基因置于这样的启动子区调控下，再在能使该启动子强力启动的营养限制条件下培养宿主，就可以增加该基因的表达。提供营养限制条件的优选方法是应用突变菌株，该突变株代谢某种养分的能力有部分缺陷，从而使一些启动子可在突变菌株中比非突变株中以高得多的水平启动表达。在毕赤中的这种表达我们将在例Ⅴ中详述。将用本发明的基因组修饰方法破坏了第一醇氧化酶的巴斯德毕赤菌株培养在用甲醇作为碳源的培养基上时，吃惊地发现它们仍能生长，只是生长率比野生型降低了。该结果说明在利用甲醇的毕赤菌株中可能存在第二醇氧化酶。在筛选毕赤染色体DNA时，分离出一个3千对碱基的片段，它似乎是为第二醇氧化酶基因(AOX2)的一部分编码的。该片段已插入到PBR322(在唯一的BamHI切点)质粒中贮存起来。该质粒称为p PG30，在大肠杆菌宿主LE392中携带。这个菌株已贮存在美国伊利诺州Peoria的美国农业部北部地区研究中心，贮藏号为NRRL B-18022。p PG3.0的限制酶切图示在图16b，并将它与第一醇氧化酶基因p PG4.0的一个片段相比较。后者在Stroman等人转让给飞利蒲石油公司的共同未决申请No666，391中已详述。比较两个醇氧化酶，(见图16)使人们更明确这两个片段不是同一基因位点的两个重复区。但两个片段的同质部分也是很清楚的。它们有几个共同的限制酶切点，这已用星号表示在图16中。一些不同的限制酶切点也说明它们在核苷酸水平上的差异。下面将通过实例叙述本发明，但不限制本发明。用于下面例子中的缓冲液及溶液如下1M·Tris缓冲液将121.1克Tris碱溶在800毫升水中;用35%HCl调节pH至所需值，达最终pH值前将溶液冷却至室温，再稀释到终体积1升。TE缓冲液1.0mM EDTA溶在0.01M(pH7.4)的Tris缓冲液中。LB培养基(Luria-Bertani)将5克细菌用胰化胨，5克细菌用酵母提取物，2.5克Na Cl悬在1升水中，用Na OH将pH调至7.5。2B培养基0.2%NH4PO4，1.2%Na2HPO4。0.013%MgSO4·7H2O，0.074%Ca Cl2·2H2O，2微克/毫升生物素，1微克/毫升硫胺素，100微克/毫升色氨酸，0.4%葡萄糖，0.2%酪蛋白氨基酸。YPD培养基1%细菌用酵母提取物，2%细菌用胨，2%葡萄糖。SD培养基6.75克不含氨基酸的酵母含氮碱溶于1升水的2%葡萄糖。SED1M山梨醇，25mM EDTA，50mMDTT。SCE缓冲液9.1克山梨醇，1.47克柠檬酸钠，0.168克EDTA，加水至50毫升，用盐酸将pH调至5.8。Ca S1M山梨醇，10m M Ca Cl2，灭菌过滤。PEG溶液20%聚乙二醇3350，10mMCaCl2，10mM Tris-HCl(pH7.4)，灭菌过滤。So S1M山梨醇，0.3xYPD培养基，10m MCa Cl2。下列缩写的意义如下EDTA 乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸钠DTT 二醇苏糖醇例1巴斯德毕赤转化步骤A.细胞培养1.将一个巴斯德毕赤GS115(NRRL Y-15851)保温培养在约10毫升YPD培养基，在30℃摇动培养12-20小时。2.12-20小时后，将培养液稀释到在600纳米处光密度约为0.01-0.1时，将对数生长期的细胞在YPD培养基中继续于30℃下培养约6-8小时。3.6-8小时后，用0.5毫升在600纳米处光密度约为0.1的种子培养液置于100毫升的YPD培养基中保温培养，在30℃下摇动培养12-20小时。4.当培养液细胞生长到在600纳米处光密度约为0.2-0.3时(约16-20小时)以1500g离心5分钟收集培养物。B.制备球状体1.在10毫升无菌水中洗收集的细胞一次，(1-5步的离心均以1500g速度，离心5分钟)。2.在10毫升的新鲜SED中洗细胞一次。3.在10毫升的无菌1M山梨醇液中洗细胞两次。4.将细胞重悬在10毫升的SCE缓冲液中。5.加入5～10毫升的4毫克/毫升的酵解酶60，000(来自Miles试验室)。将细胞在30℃下保温培养约30到60分钟。由于制备球状是转化的关键步骤，需要用下列步骤监测球状体的生成将100微升的细胞在加入酵解酶(zymolyase)前或刚加入后及在温育的不同时间加入900微升的50%SDS和900微升的1M山梨醇。当细胞在SDS中已裂解而在山梨醇中未裂解时停止温育。(通常为30到60分钟)。6.将球状体在10毫升无菌1M山梨醇中洗两次，再在1000g下离心5～10分钟收集之。(离心时间和速度可以变化)，离心使球状体沉淀又不会破裂。7.用10毫升无菌Ca S洗细胞一次。8.用0.6毫升无菌Ca S重悬细胞。C.转化1.将DNA样品(多达20微升体积)置于12×75毫米的无菌聚丙烯试管中(DNA溶在水或TE缓冲液中，为使其用少量DNA最大限度地转化，建议每个样品中加约1微升浓度为5毫升/毫升超声处理的大肠杆菌DNA。)2.每个DNA样品加100微升球状体，室温下温育20分钟。3.每个样品加入1毫升PEG溶液，室温下温育约15分钟。4.在1000g下离心样品5～10分钟，除去PEG溶液。5.将样品重悬在150微升的SOS中再在室温下温育30分钟。6.加入850微升无菌1M山梨醇，再按下述步骤平板培养。D.再生球状体1.再生琼脂培养基的配方a.将9克细菌用琼脂，13.4g KCl，240毫升H2O配制成琼脂-KCl，高压灭菌。b.将20克葡萄糖加100毫升H2O中，高压灭菌制成10X葡萄糖液。c.将6.79克不含氨基酸的酵母含氮碱加入100毫升水，高压灭菌制备10×SC(高压灭菌前或后加入任何所需氨基酸或核酸使其浓度达200微克/毫升)。d.将30毫升10×葡萄糖液和30毫升10×SC液加入240毫升融化的琼脂-KCl溶液。加0.6毫升0.2毫克/毫升的生物素和浓度高达20微克/毫升的任何其它所需氨基酸或核酸。再生琼脂是在55～60℃下融化的。2.制备转化样品的培养平板制备转化样品前至少30分钟，将10毫升再生琼脂倾入每个平板每个平板培养皿。当转化样品在SOS液中时，将10毫升再生琼脂倾入各试管。将上述制备的每份转化样品加入各试管内，然后再倾入培养皿的底部琼脂层。3.测定球状体制备质量取出10微升的某个样品，用99微升的1M山梨醇将其稀释100倍。再取出稀释的样品10微升，再用990微升1M山梨醇再稀释100倍，将100微升的两次稀释样品涂到含YPD培养基的琼脂平板，测定残留在制备液中的未成球状体的完整细胞。取每个稀释样品100微升，加到10毫升的补加40微克/毫升组氨酸的再生琼脂，测定总体可再生球状体。转化试验的良好值为每毫升含1-3×107总体可再生球状体及每毫升含约1×103的完整细胞。4.将平板在30℃下保温培养3-5天。例2在GS190(NRRL Y-1804)中定点插入Sacchayomyces ARG4基因和删掉毕赤HIS4图1表示质粒PYM I1，图2表示质粒定点插入到巴斯德毕赤基因组的情况。通过载体将Saccharomyces ARG4基因和来自PBR322的DNA序列插入毕赤HIS4位点，同时删掉了整个HIS4基因。诸如表达区的其它顺序也可容易地插入到PYM I1中，然后同时整合到巴斯德毕赤基因组。质粒PYM I1是由位于毕赤HIS4基因5′端的EcoR I-BamH Ⅰ片段和位于毕赤HIS4基因3′端的EcoR I-Cla I片段构成的。这两个HIS4基因的两侧片段可由质粒PYJ18得到(它存在于大肠杆菌宿主中，可从美国农业部北部研究中心得到，贮存号为NRRLB-15889，见图3)，它们约400对碱基长，在PYM I1的EcoR I末端处连接。作为可选择的标记，PYM I1载体含有一个来自PYM25的2，6千对碱基的Hind Ⅲ-SalⅠ片段。(PYM存在于大肠杆菌宿主，贮藏号NRRL B-18015，见图17)，它是为Saccharomyces的精氨基琥珀酸裂解酶(ARG4基因的产物)编码的。当用EcoRI切割时，PYM I9成为线状，其末端为HIS4基因的侧部片段。巴斯德毕赤arg4菌株GS190(NRRL Y-18014)是用EcoRI切割的PYM I1转化的，转化成精氨酸原养型(Arg+)。将40微克/毫升补加到再生琼脂培养基以避免对转化体的选择压力，该转化体由于删掉了HIS4基因而需要组氨酸。在Arg+转化体中选择删掉HIS4基因的HIS-型菌株。为此，将含有Arg+菌落的再生琼脂转到含25毫升无菌水的50ml容积的无菌试管中。用Brinkman Polytron均浆器在刻度5速度下搅碎琼脂约1分钟。通过三层灭菌纱布过滤将酵母细胞与琼脂分开。然后将酵母细胞超声破裂稀释，涂布在含SD培养基及补加40微克/毫升组氨酸的琼脂平板上。细胞破裂前先稀释到600纳末处消光度0.1，然后用Somifier细胞破碎机350(来自Branson Sonic Power公司)在刻度4处超声破裂10秒钟，它使细胞足以分离又不降低其活性。2-3天后，将在加有组氨酸的SD琼脂平板上生长的菌落影印到另一套SD平板，其中之一是不含组氨酸的。Arg+HIS-菌落约占总Arg+转化体的0.7%。用Southern吸印杂交法检查三个Arg+HIS-株的基因组DNA。在三个基因组内均缺少了整个HIS4基因，而且直线质粒已被插入(如图2下面所示)。此外，GS190～PYM I1菌株需要组氨酸，不再需要精氨酸，但没观察到营养需要及生长率的其它变化。例3从巴斯德毕赤NRRL Y-11430删掉HIS4基因。图4表示质粒PYMI3a，而图5表示将该质粒的一个片段线性插入到巴斯德毕赤NRRL Y-11430的HIS4位点。载体包含抗G418基因(G418R)，该基因来自PBPG1-1(存在于大肠杆菌宿主NRRL B-18020)，它作为选择标记。G418R基...
【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯迈克尔克里格，
申请(专利权)人：菲利普石油公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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