通过异种间的核移植产生的胚细胞或干细胞样细胞系制造技术

本发明专利技术提供了改良的核转移方法，所述方法包括将分化的供体细胞核植入与供体细胞不同种的去核卵母细胞中。所得的核转移单位可用于产生同基因的胚胎干细胞，尤其是人同基因的胚细胞或干细胞。这些胚细胞或干细胞样细胞可用于产生所需的分化细胞，并可用于通过同源重组在所述细胞基因组的特定位点处导入，除去或修饰所需基因。可含有异源基因的这些细胞对细胞移植疗法和体外细胞分化研究特别有用。本发明专利技术还提供了通过对供体细胞进行基因修饰而抑制细胞凋亡，选择特定的细胞周期和／或增强胚胎生长和发育而改善核转移效力的方法。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及通过将动物或人细胞的细胞核植入与供体核不同种的动物的去核卵母细胞而产生胚细胞或干细胞样细胞。本专利技术更具体地涉及通过将灵长类动物或人细胞的核植入去核的动物卵母细胞，如灵长类动物或具爪动物的卵母细胞，在优选的实施方案中为牛去核卵母细胞而产生灵长类动物或人胚细胞或干细胞样细胞。本专利技术还涉及所得的胚细胞或干细胞样细胞，优选为灵长类动物或人的胚细胞或干细胞样细胞用于治疗，诊断，产生可用于治疗或诊断的分化细胞，和产生转基因的胚或转基因的分化细胞，细胞系，组织和器官的用途。另外，本专利技术所得的胚细胞或干细胞样细胞本身也可在用于产生嵌合体或无性系，优选为转基因的克隆或嵌合动物的核移植或核转移方法中用作核供体。据报道，ES细胞具有多种用途，例如，ES细胞可用作体外分化模型，尤其是可用作研究参与早期发育调节之基因的体外模型。当将小鼠ES细胞导入植入前的小鼠胚胎时可产生种系嵌合体，从而阐明了其多能性(Bradley等，自然，309255-256(1984))。由于ES细胞能将其基因组转移至下一代，因此，ES细胞具有潜在的实用性，通过使用具有或不具有所需基因修饰的ES细胞可以对家畜进行种系操作。另外，对家畜，如具爪动物而言，从诸如植入前的家畜胚胎中得到的核能支持去核卵母细胞的按期发育(Smith等，生物繁殖，401027-1035(1989)；Keefer等，生物繁殖，50935-939(1994))。这与得自小鼠胚胎的核相反，据报道得自小鼠胚胎的核在转移后的8-细胞阶段后仍不能支持去核卵母细胞的发育(Cheong等，生物繁殖，48958(1993))。因此，得自家畜的ES细胞非常合乎需要，因为它们可提供潜在的经基因操作的或要不然可用于核转移法的全能性供体核来源。一些研究小组已报道了据称为多能性的胚细胞系的分离。例如，据Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl,43255-260(1991)报道，由猪和绵羊胚泡建立了据称为稳定的，多能性的细胞系，其中所述胚泡表现出的一些形态学和生长特性类似于通过免疫切除由绵羊胚泡分离出的内细胞团原代培养物的细胞。另外，Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl,41:51-56(1990)公开了得自猪胚泡的推定的多能性胚细胞系的维持和分化。另外，Gerfen等，动物生物技术，6(1)1-14(1995)公开了由猪胚泡分离胚细胞系。无需使用条件培养基，这些细胞可在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上稳定维持。据报道，这些细胞在培养的过程中分化为几个不同的细胞类型(Gerfen等，文献同上)。另外，Saito等，Roux’s Arch.Dev.Biol.,201134-141(1992)报道了经培养的牛胚胎干细胞-样细胞系，该细胞系可存活3代，但第4代后即消失。Handyside等，Roux’s Arch.Dev.Biol.,196185-190(1987)公开了在允许分离得自小鼠ICM的小鼠ES细胞系的条件下培养经免疫切除分离的绵羊胚胎内细胞团。据Handyside等，(1987)(文献同上)报道，在上述条件下，绵羊ICM附着，扩散和产生ES细胞样和内胚层样细胞区域，但经延长培养之后，只有内胚层样细胞清晰可见。最近，Cherny等，Theriogenology,41175(1994)报道了可在长期培养物中维持的据称为多能性的衍生自牛原生殖细胞的细胞系。培养约7天之后，这些细胞产生了ES样集落，其碱性磷酸酶(AP)的染色为阳性，所述细胞还表现出形成胚状体并自动分化成至少两种不同细胞类型的能力。据报道，这些细胞还表达了转录因子OCT4,OCT6和HES1的mRNA，而据信只有ES细胞能表达该同源框基因模式。最近，据Campbell等，自然，38064-68(1996)报道，对经培养的胚盘(ED)细胞进行核转移之后产生了活的羔羊，其中所述ED细胞得自在促使分离小鼠ES细胞系的条件下培养的9天龄绵羊胚胎，作者根据实验结果得出下列结论即通过核转移，得自9天龄绵羊胚胎的ED细胞是全能性的，并且该全能性能在培养中维持。Van Stekelenburg-Hamers等，Mol.Reprod.Dev.,40444-454(1995)报道了得自牛胚泡内细胞团细胞的据称为永久细胞系的分离和鉴定。作者在不同的条件下分离并培养了得自8或9天龄牛胚泡的ICM以确定何种饲养细胞和培养基能最有效地支持牛ICM细胞的附着和过度生长。他们根据实验结果得出结论使用STO(小鼠成纤维细胞)饲养细胞(以替代牛子宫上皮细胞)和使用炭-剥离的血清(而不是正常血清)添加至培养基中可以增强经培养的ICM细胞的附着和过度生长。然而，据Van Stekelenburg等报道，上述细胞系更类似于上皮细胞而不是多能性的ICM细胞。另外，Smith等(WO94/24274,1994年10月27日公开)，Evans等(WO90/03432,1990年4月5日公开)和Wheeler等(WO94/26889,1994年11月24日公开)报道了动物干细胞的分离，选择和增殖，据称该干细胞可用于得到转基因动物。Evans等(WO90/03432,1990年4月5日公开)还报道了由猪和牛衍生得到据称为多能性的胚胎干细胞，该胚胎干细胞据称可用于产生转基因动物。另外，Wheeler等(WO94/26884,1994年11月24日公开)公开了据称可用于制备嵌合和转基因的具爪动物的胚胎干细胞。因此，根据上述，很多研究小组显然想尝试产生ES细胞系，因为ES细胞系能潜在地用于产生克隆的或转基因的胚胎并可用于核移植。也有人报道了使用具爪动物的ICM细胞进行核移植。例如，Collas等，Mol.Reprod.Dev.,38264-267(1994)公开了通过将经裂解的供体细胞微量注射至去核的成熟卵母细胞而对牛ICM进行核移植。该文献公开了在体外将胚胎培养7天以产生15个胚泡，通过转移至牛受体，导致4个妊娠和2个出生。Keefer等.，生物繁殖，50935-939(1994)公开了在核转移方法中使用牛ICM细胞为供体核以产生胚泡，通过移植至牛受体，导致产生几个活的后代。另外，Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,906143-6147(1993)公开了通过将经短期体外培养的牛ICM细胞的核转移至去核的成熟卵母细胞中而产生小牛。另外，也有人报道了对经培养的胚盘细胞进行核转移之后产生了活的羔羊(Campbell等，自然，38064-68(1996))。还有人报道在核转移中使用牛多能性胚细胞并产生嵌合的胎儿(Stice等，生物繁殖，54100-110(1996)；Collas等，Mol.Reprod.Dev.,38264-267(1994))。另外，也有人尝试产生异种间的(cross species)NT单位(Wolfe等，Theriogenology,33350(1990))。具体地说，是将牛胚细胞与野牛的卵母细胞融合以产生一些可能具有内细胞团的异种间的NT单位。然而，在核转移方法中使用的供体核源自胚细胞而不是成年细胞。理论上，胚细胞比成年细胞更易于重编程序。该项研究与早期在蛙中进行的NT研究属于同本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生胚细胞或干细胞样细胞的方法，所述方法包括下列步骤：（ｉ）在适于形成核转移（ＮＴ）单位的条件下，将所需的分化的人或哺乳动物细胞或细胞核插入去核的动物卵母细胞中，其中所述卵母细胞得自与人或哺乳动物细胞不同的动物种；（ｉｉ）激活所得的 核转移单位；（ｉｉｉ）培养所述经激活的核转移单位直至大于２细胞发育阶段；和（ｉｖ）培养得自所述经培养的ＮＴ单位的细胞以获得胚细胞或干细胞样细胞。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J罗贝尔，J西柏利，SL史蒂斯，
申请(专利权)人：马萨诸塞大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]