磁性纳米载体介导的植物转基因方法技术

本发明专利技术提供一种磁性纳米载体介导的植物转基因方法，具体包括：将具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的磁性纳米载体与外源基因相结合，构建出基因－纳米磁颗粒载体复合物；将基因－纳米磁颗粒载体复合物与植物花粉或花药共培养，利用磁性纳米载体的高穿透性，在0.1~0.5T的磁场的驱动下，将基因－纳米磁颗粒载体复合物转入植物花粉或花药细胞，通过授粉受精过程实现外源目的基因的遗传转化。本发明专利技术方法操作简单、易于掌握、便于推广、不受外源基因种类和大小限制、打破了受体材料遗传背景的限制、直接获得转基因种子、获得转基因材料的时间短、转化效率高，可广泛应用于植物遗传转化。尤其对重要农作物的遗传改良和功能基因组的研究具有重大价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纳米生物技术和生物纳米材料应用等领域，具体指一种以。
技术介绍
植物基因工程是应用重组DNA技术，将外源基因导入到受体植物细胞内，使受体植物获得新的遗传性状。20世纪80年代，在细胞和组织培养、分子生物学研究领域取得一系列重大进展的基础上，植物基因工程到得到了迅猛的发展。棉花是我国重要的经济作物，对农业和棉纺行业的发展具有举足轻重的作用，但传统的育种方法多限于品种间或种间的染色体重组，具有很大的局限性。因此利用基因工程技术培育棉花新品种具有十分重要的意义。我国棉花生物技术研究起始于20世纪70年代，近年来随着植物转基因研究的蓬勃发展，转基因技术的不断改进和完善，转基因技术已经应用于棉花抗虫、抗除草剂、抗病、提高产量和品质改良育种的实践中，并得到了抗虫、抗除草剂、抗病等转基因新品种(系)，有些已经进入商品化生产，取得了显著的经济效益和社会效益，特别是中国农业科学院郭三堆等科学家培育成功的转基因抗虫棉的大面积推广，极大地促进了我国棉花产业的发展，不仅使棉花产量得到了显著提高，也大量减少了杀虫剂的使用，充分体现了转基因作物在农业生产中重要的经济与社会价值。因此，充分运用转基因技术，在高产、优质的棉花品种上，进一步导入抗病虫、抗除草剂、耐盐碱、耐干旱等基因，获得抗逆性优良的转基因棉花种质新材料，对转基因棉花新品种具有重要的现实意义。应用于棉花的转基因技术主要有农杆菌介导的外源基因导入方法、外源基因直接导入的花粉管通道法和基因枪法，这三种方法也是应用最广泛的植物遗传转化手段。自从1987年Umbeck和Firoozababy等通过根癌农杆菌介导转化获得第一个表达外源基因的转基因植物以来，该方法在棉花遗传转化中得到了迅速应用。当前通过各种转基因技术已获得的近200种转基因植物，其中80%以上是利用根癌农杆菌转化方法获得的。该方法以转基因低拷贝、遗传稳定性好、能够转化大片段的DNA、转化效率高等优点倍受人们的关注，是目前转化机理研究最清楚，应用最广泛的方法。棉花的遗传转化采用的根癌农杆菌为土壤喜居菌，革兰氏染色呈阴性(李俊兰，2002)。利用农杆菌转移外源基因的过程一般是(I)将目的基因导入中间载体或二元载体；(2)将带有目的基因的中间载体或二元载体导入农杆菌；(3)使农杆菌感染寄主(受体)植物细胞或组织；(4)筛选转化细胞并诱导其再生植株；(5)对转基因植株进行分子检测。农杆菌介导的基因转移所适用的外植体非常广泛，包括叶片、茎段、胚轴、叶柄、子叶、幼胚或成熟种子。在棉花上常用的为下胚轴。但是，影响农杆菌介导法的因素较多，主要有外植体类型和生理状态、外植体是否进行预培养、Vir基因活化状况、pH值、温度、渗透压、肌醇浓度以及一些糖类。棉花农杆菌介导遗传转化方法，由于其转化受体材料严格受基因型的限制、通过再生途径获得的转基因苗周期长、获得转基因苗由于其脱分化和再分化导致体细胞变异而突变率高等因素，制约了农杆菌介导的遗传转化方法在棉花基因工程中的应用。花粉管通道途径(pollen tube pathway)是周光宇等人(1978)提出DNA片段杂交理论之后设计的自花授粉后外源DNA导入植物的转基因技术。棉花胚珠在授粉之前，珠心是一个封闭的体系，授粉后随花粉管的伸入，从珠孔到胚囊的一些珠心细胞退化形成一条通道，以利于花粉管进入胚囊，外源DNA可以通过花粉管通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞从而参与到新形成的种子中。由于这些细胞不具备正常的细胞壁，可作为天然的原生质体，易于DNA转化，受精后细胞DNA复制活跃，易于外源DNA的整合。用同位素示踪技术已经证实外源DNA是通过花粉管通道而不是通过花粉管进入胚囊的(龚蓁蓁，1988 ;黄国存，1998)。黄骏麒等(1981)应用花粉管通道法成功地将抗病基因导入高产、优质、感病的棉花品种中，获得耐黄萎病、抗枯萎病的棉花3118新品种。倪万朝等(1998)通过花粉管通道法将Bt基因导入泗棉3号，选育出了我国第一批通过审定的转基因抗虫棉GKl。花粉管通道法应用于棉花基因工程，不仅打破了转化受体材料的基因型限制，无需大型仪器设备，而且整个转化过程在大田中实施、对转化条件要求比较简单、由转基因材料培育出新品种的周期短，可直接获得正常种子，因此在国内棉花遗传转化中得到了广泛的应用。但是，该方法转化后对子房机械损伤大，单棉铃的得籽率较低(单棉铃可收10粒以下种子)，转化效率较低(按照转化的花朵数算，其转化效率O. 03% O. 1%左右)，工作量大，转化用的载体骨架结构也整合于棉花基因组中，获得的转基因材料中外源DNA—般为多拷贝，后代纯合速度较慢。基因枪法又称粒子轰击法，是依赖高速度的金属微粒将外源基因引入活细胞的一种转化技术。其基本原理是通过火药爆炸高压放电或高压气体作为动力加速带有基因的金属颗粒(如金粒或钨粒)使其进入带壁细胞。在此过程中质粒首先沉淀在微弹(金粒或钨粒)表面，结合有DNA分子的微弹经加速而获得足够的动量，进而穿透植物细胞壁进入靶细胞，随后释出DNA分子并随机的整合到寄主的基因组内。Finer和Mullen (1990)以棉花胚性悬浮细胞为转化受体最先用基因枪法将⑶S和NPT II基因导入到棉花中，成功地获得了转基因棉花；吴敬音等(1994)应用基因枪轰击法将CPTI基因和NPT II基因的重组质粒导入到棉花茎尖分生组织，培养获得卡那霉素抗性植株；刘传亮等(2003)采用基因枪导入技术将外源导入受体棉花品种的茎尖或茎尖分生组织，成功地育成转基因棉花品种(系)。基因枪法由于将整个质粒表达载体通过金属颗粒引入细胞中，获得的转基因材料外源DNA—般为多拷贝，表达载体骨架结构序列也整合于基因组中；该方法也需要受体材料通过组织培养过程获得再生苗，导致转化受体材料严格受基因型的限制、通过再生途径获得的转基因苗周期长、获得转基因苗由于其脱分化和再分化引起体细胞变异而突变率高；转化用的金属颗粒比较昂贵，技术成本较高。因此该方法在棉花遗传转化中应用较少。磁性纳米颗粒作为基因载体在动物和人体细胞的基因转导已经取得了成功，在基因转导和基因治疗等方面显示了广阔的应用前景(Soeren，2004 ;庄乾元，2007)。磁性纳米颗粒作为基因载体的优点主要表现在(1)磁性纳米载体为非病毒载体，无免疫原性；(2)磁性纳米载体的比表面积大，能装载大量的大片段DNA ；(3)磁性纳米载体表面修饰带正电的PEI基团，能有效结合带负电的DNA ； (4)磁性纳米载体结合DNA能够使其免遭组织细胞中各种补体以及各种酶的破坏，且纳米载体还可以介导外源基因在细胞染色体DNA中的整合，从而获得转基因长期稳定的表达；(5)磁性纳米载体具有超顺磁性，在磁场作用下能运4送基因到目标位置，具有靶向性，能够人为进行操纵；(6)在磁性纳米颗粒表面常包覆一些生物材料，具有良好的生物相容性。利用纳米颗粒作为基因载体，将外源基因转入植物细胞，能够克服传统的植物转基因方法的不足。Torney等(2007)利用中孔氧化硅微米颗粒为载体，携带外源基因物质，成功实现了 GFP在烟草原生质体(Nicotiana tabacum)中的表达,首次将纳米基因载体带入植物细胞生物学的领域，研究指出纳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磁性纳米载体介导的植物转基因方法，其特征在于：将具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的磁性纳米载体与外源基因相结合，构建出基因－纳米磁颗粒载体复合物，将基因－纳米磁颗粒载体复合物与植物花粉或花药共培养，并以0.1~0.5T的磁场介导，进而将基因－纳米磁颗粒载体复合物转入植物花粉或花药细胞，通过植物授粉和受精过程实现外源目的基因的遗传转化。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：崔海信，孟志刚，郭三堆，孙长娇，王琰，赵翔，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，
类型：发明
国别省市：