将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法技术

通过使一个或多个核酸流与一个或多个脂质流交汇产生了具有均匀小粒度的包封核酸纳米粒。所述包封核酸纳米粒包括包封在脂质纳米粒主体内的核酸。通过使水性核酸流和在有机溶剂中的脂质流以高的线速度交汇且有机溶剂总浓度小于33％获得了均匀的小粒度。

Method for encapsulating nucleic acids in lipid nanoparticle bodies

By encapsulating one or more nucleic acid streams with one or more lipid streams, encapsulated nucleic acid nanoparticles with uniform small size are produced. The encapsulated nucleic acid nanoparticles comprise nucleic acids encapsulated in the lipid nanoparticle bodies. Uniform particle size is achieved by bringing the aqueous nucleic acid flow and the lipid flow in the organic solvent at a high linear speed, and the total organic solvent concentration is less than 33%.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法专利
本专利技术通常涉及包封核酸纳米粒组合物以及用于制备具有均匀的小粒度的包封核酸纳米粒的方法和系统。专利技术背景向受治疗者递送生物活性剂(包括治疗相关化合物)经常由于化合物到达靶细胞或组织的困难而受到阻碍。具体而言，将许多生物活性剂运输到活细胞中受到细胞的复杂膜系统的高度限制。这些限制可导致需要使用比获得结果所期望的那些高得多的浓度的生物活性剂，这增加了毒性作用和副作用的风险。一种解决该问题的方法是利用特定的载体分子和载体组合物，它们被允许选择性进入细胞内。脂质载体、可生物降解的聚合物和各种缀合系统可用于改善生物活性剂向细胞的递送。一类特别难于递送到细胞的生物活性剂是生物治疗剂(包括核苷、核苷酸、聚核苷酸、核酸和衍生物，例如mRNA和RNAi剂)。通常，核酸在细胞或血浆中仅能在有限的时间内保持稳定。RNA干扰、RNAi治疗、mRNA治疗、RNA药物、反义治疗和基因治疗等的发展已经增加了将活性核酸试剂引入细胞中的有效方式的需求。为此，对于能够稳定且递送基于核酸的活性剂到细胞中的组合物是特别令人感兴趣的。用于改善外源核酸向细胞内转运的最充分研究的方法包括使用病毒载体或含阳离子脂质的制剂。病毒载体可用于将基因有效地传递到一些细胞类型中，但是它们通常不能用于将化学合成的分子引入到细胞中。一种供选的方法是使用引入了阳离子脂质的递送组合物，其在一个部分与生物活性剂相互作用病情在另一个部分与膜系统相互作用。据报道，这类组合物根据组成和制备方法提供了脂质体、胶束、脂质复合物(lipoplexes)或脂质纳米粒(综述参见Felgner,1990,AdvancedDrugDeliveryReviews,5,162-187；Felgner,1993,J.LiposomeRes.,3,3-16；Gallas,2013,Chem.Soc.Rev.,42,7983-7997；Falsini,2013,J.Med.Chem.dx.doi.org/10.1021/jm400791q；及其中参考文献)。自从在1965年Bangham首次描述了脂质体(J.Mol.Biol.13,238-252)，对于开发用于递送生物活性剂的基于脂质的载体系统存在持续的兴趣和努力(Allen,2013,AdvancedDrugDeliveryReviews,65,36-48)。PhilipFelgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,7413-7417(1987)首次描述了通过采用带正电荷的脂质体将功能性核酸引入培养细胞中的方法。K.L.Brigham等人,Am.J.Med.Sci.,298,278-281(1989)随后在体内验证了该方法。近来，已经开发了体外和体内具有验证了的功效的脂质纳米粒制剂(Falsini,2013,J.Med.Chem.dx.doi.org/10.1021/jm400791q；Morrissey,2005,Nat.Biotech.,23,1002-1007；Zimmerman,2006,Nature,441,111-114.；Jayaraman,2012,Angew.Chem.Int.Ed.,51,8529-8533)。脂质制剂是很有吸引力的载体，因为它们能够保护生物分子不被降解并同时提高它们的细胞摄取。在各种类型的脂质制剂中，含有阳离子脂质的制剂通常被用于递送聚阴离子(例如核酸)。这类制剂可以使用单独的阳离子脂质形成，任选地包括其它脂质和两亲物如磷脂酰乙醇胺。本领域熟知的是，脂质制剂的组成及其制备方法均影响所得聚集物的结构和尺寸(Leung,2012,J.PhysChem.C,116,18440-18450)。已经报道了多种技术将核酸包封在脂质纳米粒中，包括洗涤剂透析、挤出、高速混合和逐步稀释。然而，现有的核酸包封方法具有低包封率或不可规模化的问题，产生的纳米粒缺乏高度均匀性，和/或不能获得小于80nm平均粒度。因此，需要将核酸包封在脂质纳米粒中的新方法，其产生了高包封度、可规模化并且产生了具有小于80nm的平均粒度的尺寸均匀的纳米粒。专利技术简述本专利技术涉及改善的将核酸包封在脂质纳米粒主体(host)中的方法。该方法是可规模化的，并且提供了具有小的平均粒度(例如＜80nm)、改善的粒度均匀性和高的核酸包封度(例如>90％)的包封核酸纳米粒的形成。通过本专利技术的方法产生的纳米粒具有长期稳定性。本专利技术的第一个方面提供了将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，该方法通过将一个或多个脂质流与一个或多个核酸流合并和使所述合并流流动以得到包封核酸纳米粒的第一出口溶液。每个脂质流包含一种或多种脂质在有机溶剂(例如乙醇)中的混合物。每个核酸流包含一种或多种核酸在水性溶液中的混合物。在脂质流和核酸流的交汇点，每种流都表征有线速度。所述一个或多个脂质纳米粒流具有大于或等于约1.5米/秒的复合线速度。同样，所述一个或多个核酸流具有大于或等于约1.5米/秒的复合线速度。在脂质流和核酸流合并和混合后，有机溶剂的最终浓度为使聚集最小的量(例如小于33％)。在一些实施方案中，第一出口溶液中有机溶剂的最终浓度为约20％至约25％。在第一个方面的一些实施方案中，将合并的脂质和核酸流用稀释溶剂稀释，以提供第一出口溶液。在第一个方面的其它实施方案中，合并的核酸流的复合线速度为约3至约14米/秒，脂质流的复合线速度为约1.5至约7米/秒。在本专利技术的第二个方面，所述第一出口溶液通过稀释、培养、浓缩和透析进行进一步加工。在第二个方面的一些实施方案中，透析溶液也可以是无菌过滤的。通过第二个方面的方法产生的包封核酸纳米粒具有长期稳定性。在本专利技术的第三个方面，通过本专利技术的方法产生的包封脂质纳米粒具有小于约80nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米粒具有约30至约80nM的平均直径。在优选的实施方案中，纳米粒具有小于约70nm(例如约40-70nm)的平均直径。本专利技术的第四个方面提供了包封核酸纳米粒组合物，其包含可药用载体、脂质纳米粒主体和核酸，其中所述包封核酸纳米粒具有约40nm至约70nm的平均直径。附图简述图1图解了用于制备和加工包封核酸纳米粒的示例性方法的流程图。图2图解了用于制备包封核酸纳米粒的代表性系统。图2a图解了图2的系统中使用的稀释室的供选实施方案。图3a、3b和3c图解了图2的系统中使用的混合室的供选实施方案。图4a是低温电子显微镜检查得到的图像，其图解了采用十字形混合室和方法实施例2中所述的方法和物质产生的siRNA包封脂质纳米粒的颗粒均匀性。图4b是低温电子显微镜检查得到的图像，其图解了采用T-形混合室和方法实施例2中所述的方法和物质产生的siRNA包封脂质纳米粒的颗粒均匀性。详细说明1.0概述本专利技术提供了制备具有均匀的小粒度的包封核酸纳米粒的方法。图1显示的是概括地描绘本专利技术的一个实施方案的步骤的代表性流程图。在步骤100中，一个或多个脂质流在第一交汇点与一个或多个核酸流合并，得到第一合并流。然后，使第一合并流流动(步骤110)以允许所述合并流的各个流联合，由此进行脂质纳米粒组装和核酸包封的过程。根据对初始核酸流所选择的具体参数，合并流可以任选地用水性介质进一步稀释(步骤120)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
将核酸包封在脂质纳米粒主体中以提供包封核酸纳米粒的方法，该方法包括：提供一个或多个核酸流，所述一个或多个核酸流包含核酸在第一水性溶液中的混合物，并且具有大于或等于约1.5米/秒的复合线速度；提供一个或多个脂质流，所述一个或多个脂质流包含一种或多种脂质在有机溶剂中的混合物，并且具有大于或等于约1.5米/秒的复合线速度；将所述的一个或多个脂质流与所述的一个或多个核酸流在第一交汇点合并，得到第一合并流；使第一合并流以第一个方向流动并混合其组分，得到包含包封核酸纳米粒的第一出口溶液；其中所述第一水性溶液和所述有机溶剂是可溶混的，所述第一水性溶液或所述有机溶剂中的一个含有缓冲液，并且所述第一出口溶液中的有机溶剂浓度小于33％。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.16 US 62/025,2241.将核酸包封在脂质纳米粒主体中以提供包封核酸纳米粒的方法，该方法包括：提供一个或多个核酸流，所述一个或多个核酸流包含核酸在第一水性溶液中的混合物，并且具有大于或等于约1.5米/秒的复合线速度；提供一个或多个脂质流，所述一个或多个脂质流包含一种或多种脂质在有机溶剂中的混合物，并且具有大于或等于约1.5米/秒的复合线速度；将所述的一个或多个脂质流与所述的一个或多个核酸流在第一交汇点合并，得到第一合并流；使第一合并流以第一个方向流动并混合其组分，得到包含包封核酸纳米粒的第一出口溶液；其中所述第一水性溶液和所述有机溶剂是可溶混的，所述第一水性溶液或所述有机溶剂中的一个含有缓冲液，并且所述第一出口溶液中的有机溶剂浓度小于33％。2.权利要求1的方法，其中:所述第一水性溶液为包含碱金属盐水性溶液的第一缓冲溶液；和所述有机溶剂包含醇性溶剂。3.权利要求1或2的方法，还包括：用选自第二种缓冲溶液和水的稀释溶剂稀释所述第一合并流，得到第一出口流。4.权利要求3的方法，其中：所述碱金属盐选自NaCl和柠檬酸钠中的一种或多种；和所述有机溶剂包含乙醇。5.权利要求1-4任一项的方法，其中：所述第一出口溶液中的有机溶剂浓度在约20至约25％之间。6.权利要求1-5任一项的方法，其中：所述一个或多个脂质流的复合线速度在约1.5至约4.5米/秒之间；和所述一个或多个核酸流的复合线速度在约3至约14米/秒之间。7.权利要求1或3-6任一项的方法，其中：所述一个或多个脂质流的复合线速度在约3至约4米/秒之间；和所述一个或多个核酸流的复合线速度在约9至约14米/秒之间。8.权利要求2-6任一项的方法，其中用稀释溶剂稀释所述第一合并流包括：提供稀释流，所述稀释流包含选自第二种缓冲溶液和水的水性溶剂；和将所述第一合并流与所述稀释流合并，得到第一出口流；其中所述一个或多个脂质流的复合线速度在约3至约4米/秒之间；和所述一个或多个核酸流的复合线速度在约6至约8米/秒之间。9.权利要求1-8任一项的方法，还包括培养所述第一出口溶液。10.权利要求9的方法，还包括：用选自第三种缓冲溶液和水的第二稀释溶剂稀释经培养的第一出口溶液，得到第二出口溶液；和将所述第二出口溶液进行浓缩和透析。11.权利要求10的方法，其中所述浓缩...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·A·鲍曼，N·加德纳，T·让诺特，C·瓦热塞，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH