一种鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的制备方法及其应用属于纳米材料生物学领域。将纳米金刚石经过表面氧化处理后和鱼精蛋白硫酸盐溶液混合得到混合溶液；将得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物溶解在去离子水中形成鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料，纳米金刚石通过极性相互作用吸附鱼精蛋白硫酸盐后，鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为115-117nm，表面zeta电位为31-34.1mv。将siRNA与鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料按照溶质质量比1:3混合得到siRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白转染试剂。将所述染试剂在生物学应用。本发明专利技术复合材料具有良好的生物相容性，细胞毒性较小，具有合适的理化性质，稳定性好，有良好的siRNA负载能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米材料生物学领域。本专利技术涉及一种SiRNA基因载体及其制备方法，具体涉及一种纳米材料与蛋白质相结合的基因载体及其制备方法。
技术介绍
RNA干扰(RNAi)是一种存在于植物和哺乳动物细胞中的基因沉默的自然机制。 microRNA就是人们近年来刚刚发现的一类内源的具有RNA干扰活性的小RNA。这样的小 RNA被通称为小干扰RNA。将大小在21-25bpd左右的外源双链RNA (double strand RNA, dsRNA)导入细胞即可被加工成为单链的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),与单链siRNA互补的mRNA即可被降解并抑制其翻译表达即导致基因沉默。RNAi具有较好的特异性，RNAi技术的应用将为人类疾病的基因治疗开辟一个革命性的领域，对生命科学的影响将不亚于PCR技术。目前有3种方法可以触发RNA干扰在靶细胞中引入可转录产生干扰RNA的DNA质粒；引入干扰RNA前体分子；在靶细胞中引入合成的小分子干扰RNA( siRNA)。其中，第三种方法因合成siRNA的化学反应步骤比较简单、非特异性不良反应小而引起了广泛关注。siRNA不稳定，易被酶降解，难以被细胞吞噬，高效的转染载体对于其应用的发挥至关重要。目前利用重组病毒作为siRNA体内传递载体虽然传递效率高，但是潜在的生物安全性问题限制了其应用。非病毒型siRNA载体通常包括阳离子脂质体和阳离子聚合物两大类，阳离子脂质体转染效率高，但是其生物相容性差、细胞毒性大。阳离子聚合物虽然对质粒转染效率较高，但是对于小分子量的siRNA，其转染能力较弱。因此选择合适的siRNA 传递载体，制备安全、稳定、高效的载体/siRNA复合粒子具有重要意义。纳米金刚石是一种碳纳米材料，生物相容性好，细胞毒性小，它与PEI等高分子相互作用，被用作基因载体。但是纳米金刚石与蛋白质相互作用 作为siRNA进入细胞的载体， 迄今为止，尚未见报告。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以纳米金刚石和鱼精蛋白硫酸盐相互作用形成的纳米颗粒作为siRNA传递载体，该载体制备过程快捷，生物安全性良好，细胞毒性较低，基因沉默效果良好，该载体与siRNA分子在水中通过静电相互作用，得到搭载了 siRNA的纳米输送载体。本专利技术提供一种siRNA输送载体，其活性成分为纳米金刚石与鱼精蛋白硫酸盐通过极性相互作用形成的纳米颗粒。一种鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的制备方法，其特征在于，将纳米金刚石经过表面氧化处理，得到纳米金刚石溶液；纳米金刚石溶液和鱼精蛋白硫酸盐溶液混合得到混合溶液；将得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物溶解在去离子水中形成鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料，纳米金刚石通过极性相互作用吸附鱼精蛋白硫酸盐后，鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为115-117nm，表面 zeta 电位为 31-34. lmv。进一步，所述的鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼。将siRNA与鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料按照溶质质量比1:3混合得到 siRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白转染试剂。SiRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白转染试剂在生物学领域的应用。所述的鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼，水溶性的鱼精蛋白硫酸盐通过氢键、表面电荷作用，吸附于纳米金刚石表面。其中，纳米金刚石的单个粒径为4-6nm，水溶液中动力学尺寸为40_60nm，表面 zeta电位为15-17mv。纳米金刚石经过表面氧化处理，并通过极性相互作用吸附鱼精蛋白硫酸盐后，动力学尺寸为115_117nm,表面zeta电位为31-34. lmv。从分子结构上分析，本专利技术提供的siRNA载体由鱼精蛋白硫酸盐和纳米金刚石通过极性相互作用而成，鱼精蛋白吸附于纳米金刚石表面。鱼精蛋白是一种水溶性的强阳离子蛋白质，能够与核酸的磷酸基团带的阴性电荷中和，产生强大的核酸亲和力。但是单独的鱼精蛋白因为分子量大，转染分子量较小的siRNA能力较弱，而纳米金刚石是一种碳纳米材料，与其它碳纳米材料相比，如碳纳米管，其毒性小，生物相容性较好，其表面富集大量的羟基、羧基、羰基等，易与鱼精蛋白中的氨基酸通过氢键和电荷作用相互吸引，形成鱼精蛋白包裹纳米金刚石的纳米颗粒，其表面带有强正电荷，易吸附siRNA形成基因转染载体。本专利技术的siRNA输送载体具有良好的生物相容性，细胞毒性较小，能通过自组装方式形成纳米颗粒，具有合适的理化性质，较好的稳定性，制备方法简单，可重复性高，同时拥有良好的siRNA负载能力，作为纳米载体既可以保护siRNA免受降解，又具有纳米材料特有的尺寸效应，是一种良好的siRNA基因载体。本专利技术中，随着siRNA与纳米载体质量比的变化，siRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白复合物平均粒径和表面zeta电位变化随之变化。在质量比siRNA:纳米金刚石/鱼精蛋白 =1:3的情况下，纳米金刚石/鱼精蛋白复合物能够与siRNA结合形成稳定的纳米复合物。附图说明图1为ND和ND/PR0的粒径大小；图2为ND和ND/PR0的表面zeta电位；图3为不同质 量比下ND/PRO/siRA复合物的粒径大小；图4为不同质量比下ND/PRO/siRNA复合物的表面zeta电位；图5为不同比例的ND/PRO/siRNA的琼脂糖甲醛变性胶电泳图。其中A泳道为单纯的siRNA, H泳道为单纯的ND/PR0复合物，B-G泳道分别为质量比siRNA:ND/PR0=l :1,1:2, 1: 3，1: 5，1:10，1:20 的 ND/PRO/siRNA 复合物；图6为激光共聚焦显微镜下观察到的ND/PR0负载的Cy3标记的针对EGFP的siRNA 进入EC109细胞情况。A图为白光视野；B图为364nm激发波长，454nm发射波长下蓝光视野；C图为550nm激发波长，615nm发射波长下红光视野；D图为将A、B、C三组融合得到的图像；图7为荧光显微镜下观察到的ND/PRO/siRNA对EGFP蛋白表达的抑制情况，激发波长为488nm，400倍放大倍数。A图为ND/PRO/siRNA ( + )组，B图为加入ND/PROsiRNA (-) 组；图8为ND/PRO/siRNA对EGFP蛋白表达的抑制效率。其中Notreat组为ND/PR0/ siRNA (-)，Naked siRNA 组为 siRNA ( + )，siRNA/NP 组为 ND/PRO/siRNA ( + )；图9为CCK-8法测定的ND/PR0与lipofectamine 2000细胞毒性的比较。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、纳米金刚石的制备将浓度为150mg/ml纳米金刚石(Nanodiamond, ND,以下简称ND)水凝胶(产品目录号386-8567, Tokida, Ueda, Nagano)用去离子水稀释成ND浓度为lmg/ml的水溶液,取 2ml用KQ-100DB超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)在IOOW功率下超声2h，得到ND浓度为lmg/ml的水溶液。2、纳米金刚石表面氧化将质量分数为98%硝酸和质量分数为98%硫酸按质量比硝酸硫酸=3:1混合，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鱼精蛋白?纳米金刚石复合材料的制备方法，其特征在于，将纳米金刚石经过表面氧化处理，得到纳米金刚石溶液；纳米金刚石溶液和鱼精蛋白硫酸盐溶液混合得到混合溶液；将得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物溶解在去离子水中形成鱼精蛋白?纳米金刚石复合材料，纳米金刚石通过极性相互作用吸附鱼精蛋白硫酸盐后，鱼精蛋白?纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为115?117nm，表面zeta电位为31?34.1mv。
【技术特征摘要】
1.一种鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的制备方法，其特征在于，将纳米金刚石经过表面氧化处理，得到纳米金刚石溶液；纳米金刚石溶液和鱼精蛋白硫酸盐溶液混合得到混合溶液；将得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物溶解在去离子水中形成鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料，纳米金刚石通过极性相互作用吸附鱼精蛋白硫酸盐后，鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为115-117nm,表面zeta 电位为 31-34....
【专利技术属性】
技术研发人员：盛望，曹敏军，邓雄威，曾毅，肖向茜，张芳，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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