利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法，属于生物技术制菌领域。该方法是利用产色酵母和产酒酵母种属的差异，利用双热灭活亲本并用原生质体融合的方式，使双亲本原生质体融合而再生，获得同时具有来源于不同亲本的产色产酒的融合子菌株。其工艺步骤包括两亲本菌体和两亲本原生质体的制备；两亲本原生质体融合；融合子的检出与挑选和融合子发酵性能测试及复筛。本发明专利技术方法操作简单，过程易实现，育种成功几率高；其获得的酵母融合菌株，对于酒精发酵及色素积累过程的代谢调控理论研究及提高酒精发酵生产的管理控制效率都具有积极意义；同时也为酒精工业及色素生产的菌种选育提供了新的途径。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法，其特征在于依次包括以下工艺步骤：　　（１）两亲本菌体的制备　　分别将具有产乙醇和产色素能力的两亲本酵母细胞接种于酵母膏蛋白胨葡萄糖琼脂培养基即ＹＰＤ固体培养基斜面上，待生长时间１８～２４小时后，刮取斜面上生长的酵母细胞，制得细胞浓度为１０↑［７］～１０↑［９］个／ｍＬ的菌悬液，吸取２００μＬ菌悬液，接种于经１１５～１２５℃和１５～２５分钟灭菌的ＹＰＤ液体培养基的瓶中，置于２８～３２℃的恒温摇床中培养１０～１８小时，制得两入一接种环相应菌种，每３ｈ观察１次，记录杜氏管中气泡产生情况，选出产生气泡多的融合子，即发酵性能好的融合子；分别将发酵性能好的融合子斜面菌苔２－３环接种于１１５～１２５℃、１５～２５分钟灭菌的麦芽汁发酵培养基中，２５～３２℃恒温振荡培养发酵３～７天，待发酵液有明显酒味后，取样常压蒸馏，并用酒精计测定蒸馏液的酒精度数，选出产乙醇能力强的融合子菌株。亲本菌体；　　（２）两亲本原生质体的制备　　将步骤（１）的两亲本菌体培养液以浓度为０．４～０．９ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ离心洗涤三次，再将洗涤的菌体细胞稀释到浓度为１０↑［６］～１０↑［７］个／ｍＬ，取１０ｍＬ稀释后的菌悬液，用４℃冷冻离心机离心２～４分钟，再加入５ｍＬ浓度为８～１２ｍｇ／ｍＬ的蜗牛酶液酶解，轻摇使离心后的菌体和酶液充分混合，再置于温度２８～３２℃、转速１５０～２００ｒ／ｍｉｎ的恒温摇床中，酶解９０～１５０分钟；然后将酶解后的酵母细胞悬液置于４℃冷冻离心机中用０．４～０．９ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液洗涤两次，离心洗涤条件为２２００ｒ／ｍｉｎ、４分钟，再将其悬于５ｍＬ，０．４～０．９ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液中，即制得两亲本原生质体；　　（３）两亲本原生质体融合　　于６５～９５℃下分别对产酒酵母和产色酵母的原生质体灭活１５～４５分钟后，将两亲本原生质体悬液在离心管中等量混合，于４℃冷冻离心机中２２００ｒ／ｍｉｎ离心４分钟，然后加入配比为２０～４０％ＰＥＧ６０００、０．０１ｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ↓［２］、０．４～０．９ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的融合剂，混匀后放入恒温培养箱中，２５～３５℃保温，静置３０～４５分钟以待融合；取出融合后酵母原生质体悬液，放入冷冻离心机中，在２２００ｒ／ｍｉｎ、４分钟条件下用０．４～０．９ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液离心洗涤两次，以将融合剂洗净，将洗涤后的原生质体重悬于０．４～０．９ｍｏｌ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张文学，王燕，吴正云，王蓉，郭泓辰，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]