一种茶树原生质体的提取方法技术

一种茶树原生质体的提取方法，属于植物原生质体技术领域。该方法用茶树花瓣作为提取材料，由花朵采集、原生质体酶解、释放和纯化四个步骤完成。上述一种茶树原生质体的提取方法，分离材料易于得到，提取操作简单，分离得到的原生质体数量多，得率高，完整性高，为原生质体转染及原生质体融合奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】


本专利技术属于植物原生质体
，具体为一种茶树原生质体的提取方法。

技术介绍

茶树（Camelliasinensis(L.)O.Kuntze）属于山茶科山茶属，为多年生木本植物，有悠久的栽培历史，是重要的饮料植物。与其它植物相比，茶树芽叶中含有极其丰富的儿茶素、茶氨酸等特征性次生代谢产物，使得茶叶具有独特的色、香、味品质，同时也增进了人体健康。
植物原生质体是指除去了全部细胞壁后质膜包裹的细胞，原生质体不仅具有活细胞的性质，而且可以融合形成杂种细胞，它可直接摄取外源的DNA，是进行遗传转化和基因功能研究的理想受体。离体的原生质体具有细胞全能性，在适宜的无菌条件下可以生长、分化、再生成完整植株。茶树基因功能的研究需要借助于原生质体来实现茶树基因的亚细胞定位、蛋白的相互作用等，另外，利用原生质体融合进行体细胞杂交，可以打破了茶树有性杂交不亲和的生殖障碍。这些都需要得到高制备率和高活性的茶树原生质体。目前，从高等植物中分离得到的原生质体，大多是草本植物，而木本植物很难分离得到原生质体。茶树原生质体制备研究鲜有报道，用茶树叶片分离原生质体通常存在得率低，完整性也低的缺陷，满足不了后续实验的要求。本专利技术用茶树花瓣为研究材料进行酶解，释放得到原生质体，纯化后获得了数量多、纯度高的原生质体，为茶树基因改良、基因功能等研究奠定了一定的技术基础。

技术实现思路

针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术的目的在于设计提供一种茶树原生质体的提取方法的技术方案，该方法用茶树花瓣作为提取材料，由花朵采集、原生质体酶解、释放和纯化四个步骤完成；该方法的分离材料易于得到，提取操作简单，分离得到的原生质体数量多，得率高，完整性好，为原生质体转染及原生质体融合奠定了基础。
所述的一种茶树原生质体的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
1）在茶花盛开季节选取长势较好、无病虫害的茶树花朵；
2）用新刀片或剪刀将置于洁净白纸上的花瓣前端和尾部去除后，快速将中间部分切成0.5-1mm宽的细条，快速、轻柔地转移到盛有酶解液的培养皿中，并使花瓣完全沉浸于酶解液中；
酶解液配制：19-21mM2-(N-吗啉代)乙磺酸，1.4-1.6﹪纤维素酶R10，0.3-0.5﹪离析酶R10，0.3-0.5M甘露醇，19-21mM氯化钾，加入以上试剂后先50-60℃水浴加热8-15分钟，冷却至室温后再加入9-11mM氯化钙，4-6mMβ-巯基乙醇，0.8-0.12﹪牛血清蛋白，定容后调pH至5.5-5.8，0.45μm过滤灭菌，现用现配；
3）盖上皿盖，置于真空泵中于黑暗条件下抽真空40min-1h，抽真空后，继续置于黑暗条件下放置3.5-4.5h，轻柔晃动，若看到花瓣呈透明状并已萎蔫，说明原生质体已经基本释放完全，将培养皿置于显微镜下观察释放情况；
4）用洗涤缓冲液稀释上述原生质体溶液，轻轻晃动混匀；
洗涤缓冲液配制：1.8-2.2mM2-(N-吗啉代)乙磺酸，150-158mM氯化钠，122-127mM氯化钙，4.8-5.2mM氯化钾，定容后调pH至5.5-5.8，0.45μm过滤灭菌；
5）用无菌水清洗70μm的尼龙网，晾干后用洗涤缓冲液润湿尼龙网，过滤步骤4）中的酶解液，再用洗涤缓冲液洗培养皿2-3次，洗涤缓冲液的用量和所用酶解液等体积；
6）将原生质体悬浮液移至50ml离心管，室温下最大离心力100×g，离心机升速和降速的制动设为1-2，离心3.5-4.5min，弃上清，收集原生质体。
所述的一种茶树原生质体的提取方法，其特征在于步骤2）中：所述的酶解液配制：20mM2-(N-吗啉代)乙磺酸，1.5﹪纤维素酶R10，0.4﹪离析酶R10，0.4M甘露醇，20mM氯化钾，加入以上试剂后先55℃水浴加热10分钟，冷却至室温后再加入10mM氯化钙，5mMβ-巯基乙醇，0.1﹪牛血清蛋白，定容后调pH至5.7，0.45μm过滤灭菌。
所述的一种茶树原生质体的提取方法，其特征在于步骤3）中：抽真空45min-55min，继续置于黑暗条件下放置4h。
所述的一种茶树原生质体的提取方法，其特征在于步骤4）中：洗涤缓冲液配制：2mM2-(N-吗啉代)乙磺酸，154mM氯化钠，125mM氯化钙，5mM氯化钾，定容后调pH5.7，0.45μm过滤灭菌。
所述的一种茶树原生质体的提取方法，其特征在于步骤6）后：向上述原生质体中加入10mL冰浴的洗涤缓冲液，冰浴28-32min，在此期间取少量原生质体在显微镜下用细胞计数器进行计数；100×g离心2min，弃上清，将原生质体转移至2mL离心管，用适量渗透保护剂重悬原生质体后用于后续实验；渗透保护剂配制：3.8-4.2mM2-(N-吗啉代)乙磺酸中包含0.38-0.42M甘露醇，14-16mM氯化镁，定容后调pH至5.5-5.8，0.45μm过滤灭菌。
所述的一种茶树原生质体的提取方法，其特征在于：渗透保护剂配制：4mM2-(N-吗啉代)乙磺酸中包含0.4M甘露醇，15mM氯化镁，定容后调pH至5.7，0.45μm过滤灭菌。
上述一种茶树原生质体的提取方法，用茶树花瓣作为提取材料，由花朵采集、原生质体酶解、释放和纯化四个步骤完成；该方法的分离材料易于得到，提取操作简单，分离得到的原生质体数量多，得率高，完整性好，为原生质体转染及原生质体融合奠定了基础。
附图说明
图1将花瓣切成细条沉浸于酶解液中；
图2为本专利技术酶解分离和纯化后的茶树花瓣原生质体图；
图3为用本专利技术提取方法提取的茶树成熟叶片原生质体图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。
实施例1
1）在茶花盛开季节选取30朵长势较好、无病虫害的茶树花朵；
2）用新刀片或剪刀将花瓣的前端和尾部去除后，快速将中间部分切成0.5-1mm宽的细条，快速、轻柔地转移到盛有15ml酶解液的培养皿中，并使花瓣完全沉浸于酶解液中；
酶解液配制：19mM2-(N-吗啉代)乙磺酸，1.4﹪纤维素酶R10，0.3﹪离析酶R10，0.3M甘露醇，19mM氯化钾，加入以上试剂后先50℃水浴加热8分钟，冷却至室温后再加入9mM氯化钙，4mMβ-巯基乙醇，0.8﹪牛血清蛋白，定容后调pH至5.5，0.45μm过滤灭菌，现用现配；
3）盖上皿盖，置于真空泵中于黑暗条件下抽真空40min，抽真空后，继续置于黑暗条件下放置3.5h，轻柔晃动，若看到花瓣呈透明状并已萎蔫，说明原生质体已经基本释放完全,将培养皿置于显微镜下观察释放情况；
4）用洗涤缓冲液稀释上述原生质体溶液，轻轻晃动混匀；
洗涤缓冲液配制：2mM2-(N-吗啉代)乙磺酸，154mM氯化钠，125mM氯化钙，5mM氯化钾，定容后调pH至5.5，0.45μm过滤灭菌过滤除菌；
5）用水清洗70μm的尼龙网，晾干后用洗涤缓冲液润湿尼龙网，过滤步骤4）中的酶解液，再用洗涤缓冲液洗培养皿2次，洗涤缓冲液的用量和所用酶解液等体积；
6）将原生质体悬浮液移至50ml离心管，室温100g离心3.5min，离心机升速和降速的制动设为1-2，以防止原生质体在离心过程中出现机械破损，弃上清，收集原生质体；
7）向上述原生质体中加入10mL冰浴的洗涤缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茶树原生质体的提取方法，其特征在于包括以下步骤：1）在茶花盛开季节选取长势较好、无病虫害的茶树花朵；2）用新刀片或剪刀将置于洁净白纸上的花瓣前端和尾部去除后，快速将中间部分切成0.5‑1 mm 宽的细条，快速、轻柔地转移到盛有酶解液的培养皿中，并使花瓣完全沉浸于酶解液中；酶解液配制：19‑21 mM 2‑(N‑吗啉代)乙磺酸，1.4‑1.6﹪纤维素酶R10，0.3‑0.5﹪离析酶R10，0.3‑0.5 M甘露醇，19‑21 mM氯化钾，加入以上试剂后先50‑60℃水浴加热8‑15分钟，冷却至室温后再加入9‑11 mM氯化钙，4‑6 mM β‑巯基乙醇，0.8‑0.12﹪牛血清蛋白，定容后调pH至5.5‑5.8，0.45 µm过滤灭菌，现用现配；3）盖上皿盖，置于真空泵中于黑暗条件下抽真空40 min‑1 h，抽真空后，继续置于黑暗条件下放置3.5‑4.5 h，轻柔晃动，若看到花瓣呈透明状并已萎蔫，说明原生质体已经基本释放完全，将培养皿置于显微镜下观察释放情况；4）用洗涤缓冲液稀释上述原生质体溶液，轻轻晃动混匀；洗涤缓冲液配制：1.8‑2.2 mM 2‑(N‑吗啉代)乙磺酸，150‑158 mM氯化钠，122‑127 mM氯化钙，4.8‑5.2 mM氯化钾，定容后调pH至5.5‑5.8，0.45 µm过滤灭菌；5）用无菌水清洗70 µm的尼龙网，晾干后用洗涤缓冲液润湿尼龙网，过滤步骤4）中的酶解液，再用洗涤缓冲液洗培养皿2‑3次，洗涤缓冲液的用量和所用酶解液等体积；6）将原生质体悬浮液移至50 ml离心管，室温下最大离心力100× g，离心机升速和降速的制动设为1‑2，离心3.5‑4.5 min，弃上清，收集原生质体。...

【技术特征摘要】
1.一种茶树原生质体的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
1）在茶花盛开季节选取长势较好、无病虫害的茶树花朵；
2）用新刀片或剪刀将置于洁净白纸上的花瓣前端和尾部去除后，快速将中间部分切成0.5-1mm宽的细条，快速、轻柔地转移到盛有酶解液的培养皿中，并使花瓣完全沉浸于酶解液中；
酶解液配制：19-21mM2-(N-吗啉代)乙磺酸，1.4-1.6﹪纤维素酶R10，0.3-0.5﹪离析酶R10，0.3-0.5M甘露醇，19-21mM氯化钾，加入以上试剂后先50-60℃水浴加热8-15分钟，冷却至室温后再加入9-11mM氯化钙，4-6mMβ-巯基乙醇，0.8-0.12﹪牛血清蛋白，定容后调pH至5.5-5.8，0.45μm过滤灭菌，现用现配；
3）盖上皿盖，置于真空泵中于黑暗条件下抽真空40min-1h，抽真空后，继续置于黑暗条件下放置3.5-4.5h，轻柔晃动，若看到花瓣呈透明状并已萎蔫，说明原生质体已经基本释放完全，将培养皿置于显微镜下观察释放情况；
4）用洗涤缓冲液稀释上述原生质体溶液，轻轻晃动混匀；
洗涤缓冲液配制：1.8-2.2mM2-(N-吗啉代)乙磺酸，150-158mM氯化钠，122-127mM氯化钙，4.8-5.2mM氯化钾，定容后调pH至5.5-5.8，0.45μm过滤灭菌；
5）用无菌水清洗70μm的尼龙网，晾干后用洗涤缓冲液润湿尼龙网，过滤步骤4）中的酶解液，再用洗涤缓冲液洗培养皿2-3次，洗涤缓冲液的用量和所用酶解液等体积；
6）将原生质体悬浮液移至50ml离心管，室温下最大离心力100×g，离心机升速和降速的制动设为1-2，离心3.5-4.5mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：王璐，钱文俊，王新超，李娜娜，杨亚军，
申请(专利权)人：中国农业科学院茶叶研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33