在生物反应器中增殖植物胚发生组织的方法技术

本发明专利技术提供在生物反应器中增殖植物胚发生组织的方法。所述在生物反应器中增殖植物胚发生组织的方法具体地包括以下步骤：(a)将植物胚发生组织和增殖培养基接种到生物反应器中；(b)测量生物反应器中植物胚发生组织浓度的直接测量参数，或与所述浓度相关的参数；(c)使用步骤(b)中获得的测量结果计算补加的增殖培养基的流速；(d)基于步骤(c)中计算的流速向生物反应器中输送补加的增殖培养基；以及(e)定期重复步骤(b)到(d)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在生物反应器中増殖植物胚发生组织的方法。
技术介绍
体细胞克隆是自植物组织而非雌雄配子产生遗传均一植株的方法。在一个体细胞克隆方法中，植物组织在包含激素，例如生长素和/或细胞分裂素的起始培养基中培养，以起始能发育成体细胞胚的胚发生组织，例如胚性胚柄团的形成。然后将胚发生组织在促进胚发生组织定殖和增殖的增殖培养基中进ー步培养以形成前子叶胚(即，未形成子叶的 胚)。然后将前子叶胚在促进子叶体细胞胚发育和成熟的发育培养基中培养，可以将所述子叶体细胞胚，例如置于萌发培养基中以生成萌芽(germinant)，随后转移到土壌中进ー步生长，或者，将其置于人工种子中并播种入土壌中，在土壌中其萌发产生幼苗。在实验室中，植物组织体细胞克隆的増殖(維持)阶段通常采用分批法(也称作分裂法(splitting))在摇瓶中进行液体悬浮培养。在分批培养法的实施中，将胚发生组织在液体増殖培养基中培养一段时间；将胚发生组织自増殖培养基中分离(例如，通过使胚发生组织自培养基中沉淀)；而后，胚发生组织的等分试样被移出并接入単独体积的新鮮増殖培养基中进ー步培养。根据需要重复多次该方法以产生多重各包括分批的胚发生组织培养物的容器。除了容器容积小且数量多以外，该方法还难以控制摇瓶内的生长条件，且不同摇瓶间存在培养物变异性。尽管分批培养法可用于实验室规模，但将分批法用于体细胞胚的商业规模的生产是不切实际的。生物反应器更适合于大規模生产并且与摇瓶、分批法相比具有若干优点，包括自动化以及更紧密的监测和控制培养环境，例如PH值、糖浓度、溶解氧、和ニ氧化碳的能力，从而与摇瓶法相比，能获得更均一的培养物和更高产量的高品质体细胞胚。用于植物胚发生组织増殖的商业规模的液体生物反应器的成功操作需要生物质浓度的自动化调节。在生产环境下，通过快速増殖有活力的胚发生组织而获得成功。用于増殖植物胚发生组织的生产友好型方法是在补料分批生物反应器中进行，其中将少量植物胚发生组织和増殖培养基接种到所述生物反应器中，且随时间添加补加的増殖培养基直到达到足够体积的植物胚发生组织(生物质)或达到生物反应器的最大体积。生物质浓度的调节是重要的，因为生物反应器中的生物质浓度与培养基组分和细胞外产物的浓度之间密切相关。有两大类细胞外组分一类诱导体细胞胚发生以及ー类抑制体细胞胚发生。众所周知，需要最低的生物质浓度以诱导体细胞胚发生，同时也已显示，在高的生物质浓度下体细胞胚发生被抑制。与生物质浓度成反比的关键的培养基组分是糖和植物激素。在高的生物质浓度下，上述两类培养基组分可能被耗尽。糖浓度是重要的，因为其在液体増殖培养基中是首要的渗透剂。为了调节生物质浓度，应当以与生物质生长最匹配的速度添加増殖培养基。可是，这很困难，因为生物质的实际生长速度可能显著偏离先验的估计，且在指数増加的生物质生长条件下，生物质浓度可能失控。另ー个困难是可能会向补料分批反应器中接种少量的培养物，并在一段较长的时间，例如，数周，补料培养基，其可能导致生物反应器中生物质严重供料不足或供料过多。本专利技术提供了在生物反应器中増殖植物胚发生组织的方法。
技术实现思路
本内容用于以简化的方式介绍在详述中被进ー步描述的那些概念。本内容的目的既不在于明确要求保护的主题的关键性特征，也不在于辅助确定要求保护的主题的范围。 本专利技术提供了在生物反应器中増殖植物胚发生组织的方法。本专利技术的方法各包括以下步骤(a)将植物胚发生组织和増殖培养基接种到生物反应器中；(b)測量生物反应器中植物胚发生组织浓度的直接测量參数，或与所述浓度相关的參数；(C)使用步骤(b)中获得的測量结果计算补加的増殖培养基的流速；(d)基于步骤(C)中计算的流速向生物反应器中输送补加的増殖培养基；以及(e)定期重复步骤(b)到(d)。生物反应器中植物胚发生组织浓度的直接测量參数或与所述浓度相关的參数包括干重浓度、糖浓度(按白利糖度(Brix)測量)和电容。也可以测量其他參数，例如鲜重浓度、pH值、不透明度、电导和红外吸收。本专利技术的方法可用于增殖任意属/种的植物胚发生组织，包括针叶树，例如松科(Pinacea)植物,包括松属(Pinus)的成员(例如,火炬松(Pinus taeda)),或黄杉属的成员(例如，花旗松(Pseudotsuga menziesii))。附图说明參考附图可以更容易地意识到本专利技术前述的各方面及与之相随的优点，就像通过參考随后的详述可以更好地理解一祥，其中图I是生物反应器中培养基的按百分比白利糖度测量的糖浓度与反应器中生物质浓度之间的相关性的图解；图2是生物反应器中培养基的电容与反应器中生物质浓度之间的相关性的图解；图3是一段时间的生物反应器中按白利糖度测量的培养基的糖浓度的图解，其中添加到培养物的増殖培养基的量是估计的而非用比例积分控制器计算的；以及图4是当添加到培养物的増殖培养基的量是用比例-积分控制器计算时，一段时间的生物反应器中按白利糖度测量的培养基的糖浓度的图解。专利技术详述在此使用吋，术语“生物质”是指植物胚发生组织。在此使用吋，术语“植物胚发生组织”指形成胚性胚柄团的几十个到几百个细胞的隹A ロ ο在此使用吋，术语“胚性胚柄团”(ESM)指在通过出芽或卵裂的增殖过程中的早期胚。在此使用吋，术语“补料分批过程”指组织培养分批过程，其中将少量植物胚发生组织和増殖培养基接种入生物反应器，并且随时间添加补加的増殖培养基直到达到足够的生物质的量或达到生物反应器的最大容积。体细胞胚发生过程是植物胚的体外发育过程，包括以下步骤(I)起始，以引发胚发生组织(例如胚性胚柄团(ESM))的形成；(2)増殖，有时称作維持，以建立和増殖胚发生组织以形成前子叶胚；(3)发育，以发育和形成成熟子叶体细胞胚；和(4)后发育步骤，例如分层处理、萌发、置于人工种子中和为进一歩生长和发育向土壤中转移。 本专利技术涉及体细胞胚发生过程的增殖阶段。本专利技术提供了ー种在生物反应器中増殖植物胚性组织的方法，包括下列步骤(a)将植物胚发生组织和増殖培养基接种到生物反应器中；(b)測量生物反应器中植物胚发生组织浓度的直接测量參数，或与所述浓度相关的參数；(C)使用步骤(b)中获得的測量结果计算补加的増殖培养基的流速；(d)基于步骤(c)中计算的流速向生物反应器中输送补加的増殖培养基；以及(e)定期重复步骤(b)到(d)。在本专利技术中，植物胚发生组织(例如ESM)和增殖培养基被接种到生物反应器中。向生物反应器中添加植物胚发生组织和増殖培养基的顺序无关紧要。举例来说，胚发生组织和增殖培养基可以作为一个样品一起加入生物反应器；或者，先向生物反应器中加入组织，随后加入培养基；或者先向生物反应器中加入培养基，随后加入胚发生组织。配制増殖培养基以促进胚性胚柄团的生长和増殖。培养基可以包括激素。可以包括在培养基中的激素的实例是生长素(例如，2，4_ニ氯苯氧基こ酸(2，4-D))和细胞分裂素(例如，6-苄基氨基嘌呤(BAP))。生长素可以，例如，lmg/L到200mg/L的浓度使用。细胞分裂素可以，例如，O. lmg/L到50mg/L的浓度使用。増殖培养基包括維持胚发生组织的营养物质。尽管不是必须的，但通常需要的是，在増殖培养基中包含麦芽糖作为单ー的、或主要的可代谢糖源。有用的麦芽糖浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.31 US 61/319,7631.对本发明的实施方案作如下限定，在本发明中请求排他性质或特权在生物反应器中增殖植物胚发生组织的方法，所述方法包括以下步骤 (a)将植物胚发生组织和增殖培养基接种到生物反应器中； (b)测量生物反应器中植物胚发生组织浓度的直接测量参数，或与所述浓度相关的参数； (C)使用步骤(b)中获得的测量结果计算补加的增殖培养基的流速； (d)基于步骤(C)中计算的流速向生物反应器中输送补加的增殖培养基；以及 (e)定期重复步骤(b)到⑷。2.权利要求I的方法，其中参数是干重浓度。3.权利要求I的方法，其中参数选自糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼·P·斯万达，
申请(专利权)人：韦尔豪泽NR公司，
类型：
国别省市：