用于在植物胚组织中进行基因表达的调节序列制造技术

本发明专利技术涉及产生转基因植物的组合物与方法。具体地说，本发明专利技术涉及玉米金属硫蛋白基因转录调节序列，该序列可用于指导异源ＤＮＡ在植物胚组织中表达。本发明专利技术还涉及包含该启动子序列的表达盒以及包含该表达盒的转基因植物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物分子生物学。具体地说，其涉及可用于在所选目的植物组织和器官中进行基因表达的启动子序列。在植物遗传工程学中，分离的植物启动子可用来产生具有期望表型的转基因植物。为产生这样的转基因植物，可将分离的植物启动子插入载体，并可操作地连上异源DNA序列。随后，用该载体转化植物细胞，使得该启动子控制异源DNA的表达。一些植物启动子是组织特异性的；而其它的为组成型的启动子，它们在基本上所有的组织和器官中启动表达。可从在特定组织或发育过程中的特定时间表达的基因鉴定组织特异性启动子。在植物遗传工程学中，需要各种各样不同的启动子。新的组织特异性启动子对在转基因植物中有控制地表达各种核酸序列特别有用。本专利技术将满足这种需求和其它需求。本专利技术提供胚特异的玉米金属硫蛋白启动子。该启动子可用于提供异源序列在植物中的胚特异性表达。具体的说，该启动子可用于玉米中的表达。更具体地说，本专利技术提供一种分离的DNA分子，其包含SEQ ID NO5中的第50到1649位碱基对，或该序列保留在植物细胞中充当胚特异性启动子的能力的片段、遗传变体或缺失。本专利技术还提供包含与异源核酸序列可操作地连接的胚特异性启动子的表达盒，其中该启动子可任选地与SEQ ID NO5所示序列的20个连续碱基对的部分杂交。本专利技术还提供表达盒，其中启动子包含SEQ ID NO5约第50位核苷酸到第1649位核苷酸的序列。本专利技术还提供在植物中表达异源核酸序列的方法，其包括a)将含有与异源核酸序列可操作地连接的胚特异性玉米金属硫蛋白启动子的载体导入植物细胞；和b)使该植物组织再生为全株。本专利技术还提供一种分离的DNA分子，其有一段20碱基对(bp)的核苷酸部分与SEQ ID NO5所示序列的20bp连续碱基对的部分相同。本专利技术还提供含如上所述的表达盒的转基因植物。该植物将是农业上有用的任何植物。定义本文所用的术语“核酸”是DNA或RNA。“核酸序列”或“多核苷酸序列”是指从5’向3’端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链聚合物。位于DNA链上的从5’到该DNA编码的RNA转录本5’末端的序列区称为“上游序列”。上游序列通常是从转录起点负方向计数。而位于DNA链上的从3’到该RNA转录本3’末端的序列区称为“下游序列”。术语“启动子”是指RNA聚合酶和其它蛋白质识别和结合以起始转录的翻译起始密码子上游的DNA区。“植物启动子”是指能够在植物细胞中起始转录的启动子。本文所用的术语玉米金属硫蛋白启动子是指含有源于玉米金属硫蛋白基因启动子区域的序列的植物启动子。本专利技术的启动子包含组织特异性元件，其允许可操作地连接的DNA序列胚特异性转录。由于可操作连接的DNA的转录在胚组织中比在其它组织中高，因此认为该启动子是胚特异性启动子。本文所用的“组织特异性”启动子是指能够在特定的植物组织中，或是在植物生活史的特定阶段内启动可操作连接的核酸序列表达的启动子。“可操作连接”是指DNA序列上游的启动子的连接，使得该启动子介导该DNA序列的转录。可以理解，启动子序列包括转录起始和翻译起始、翻译起始密码子之间的转录序列。“表达盒”是指能够影响与核苷酸序列相容的宿主中结构基因表达的核苷酸序列。该表达盒至少包括启动子，并任选地包括转录终止信号。正如本文所述，还可使用其它实现表达所必需的或有帮助的因子。“异源”核酸或蛋白是指源于外源来源(或种)的核酸或蛋白，或者，如果是相同来源，则是对其最初的形式进行了修饰的核酸或蛋白。因此，在表达盒中的异源启动子序列来自与编码序列来源不相同的来源，或者，如果来源相同，也是对其最初的形式进行了修饰的。修饰可以按如下方法产生，例如用限制性内切酶处理DNA以产生启动子元件，其中该启动子元件能赋予包括它的表达盒组织特异性表达。当指多核苷酸或蛋白时，“分离的”或“基本上纯的”是指没有其来源生物的其它亚细胞成分的化学组成。典型地，当至少约85％或更多的样品显示单一的多肽主链或多核苷酸序列时，该化合物是基本上纯的。典型地，少量变体或化学修饰可共有相同的多肽序列。取决于纯化步骤，85％的纯度，优选95％以上的纯度是可能的。核酸和蛋白的纯度或匀质性可通过许多本领域熟知的技术来确定，如凝胶电泳等等。术语“植物”包括全植物、植物器官(如叶、茎、根等)、种子和植物细胞，以及它们的后代。可用于本专利技术方法的植物类别一般和可使用转化技术的高等植物类别一样宽，包括单子叶植物和双子叶植物。多核苷酸和多肽的“序列一致性百分比”是通过在比较窗口比较两个最佳对比的(aligned)序列来确定的，其中在与参考序列(其不包括增加或缺失)比较以获得两序列的最佳对比(alignment)时，比较窗口中的多核苷酸和多肽序列部分可包含增加或缺失(如缺口(gap))。所述百分比是通过如下方法计算确定两序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的总位置数，并将该结果乘以100次，得出序列一致性百分比。用于比较的最佳序列对比，可以通过已知算法的计算机化执行(如Wisconsin GeneticsSoftware Package中的GAP、BESTFIT、PASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，Wis，或可从National Center for Biotechnology Information获得的BlastN和BlastX)或通过观察来进行。典型地，使用GESTFIT或BlastN采用缺省参数进行序列比较。多核苷酸序列的“基本一致”是指多核苷酸序列包含具有至少75％的序列一致性，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的序列一致性的序列。典型地，如果两多肽至少40％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％是相同的或是保守替代，则认为这两个多肽基本相同。除了不一致的残基位置可能由于保守氨基酸的改变而不同外，“基本相似”的多肽与以上提到的序列相同。“保守氨基酸替代”是指具有相似侧链的残基可相互替换。另一个含义是，如果在严格条件下两分子有选择性地相互杂交，则多核苷酸序列基本一致。“有选择性地杂交”是指当总细胞DNA或RNA制品中存在靶标序列时，核酸探针仅与特定的靶标DNA或RNA杂交或结合。“严格条件”随序列不同而改变，且在不同的环境中不同。一般地，严格条件选择在一定的离子强度和pH值下，比特定序列的溶解温度(Tm)低约20℃。Tm(限定的离子强度和pH值)是指50％的靶标序列与完全匹配的探针杂交时的温度。序列的简要描述SEQ ID NO1是SK引物的DNA序列SEQ ID NO2是玉米Ec金属硫蛋白的cDNA序列SEQ ID NO3是克隆651的DNA序列，包含玉米Ec金属硫蛋白编码区的头233个碱基SEQ ID NO4是T3引物的DNA序列SEQ ID NO5是克隆MGN111-1的DNA序列本专利技术提供可用于期望核酸序列在植物胚中表达的新的植物启动子序列。具体地说，本专利技术提供含有从源于玉米金属硫蛋白基因的启动子获得的序列的分离核酸分子。本专利技术的启动子序列能用于启动各种异源核酸序列在转基因植物胚组织中的表达。I.玉米金属硫蛋白启动子的分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的ＤＮＡ分子，其含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５的第５０到１６４９位碱基对，或该序列保留了在植物细胞中充当胚特异性启动子的能力的片段、遗传变体或缺失。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：K阿姆斯特朗，DR佩尔迪，AT伍斯利，BC鲁宾威尔森，TD海伊，O福克茨，KA史密斯，
申请(专利权)人：道农业科学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]