赤豆叶肉原生质体分离培养与绿苗分化技术制造技术

本发明专利技术是赤豆叶肉原生质体分离培养与绿苗分化的组织培养技术。本发明专利技术采用特定的酶液及酶解方法游离得叶肉原生质体；采用特定的大量元素及维生素成份，采用特定的碳源及渗透压稳定剂，采用特定的激素配比方式等制成赤豆叶肉原生质体生长培养基；采用特定的激素配比方式制成愈伤组织扩增及分化培养基；采用特定波长的光照及温度作培养条件。采用本发明专利技术技术，原生质体能持续分裂，形成愈伤组织并最终分化成绿苗。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是赤豆(Phaseolus angularis)叶肉原生质体的分离制备、培养、愈伤组织诱导、扩增及绿苗分化的整套方法。本专利技术适用于豆科植物菜豆属赤豆(Phaseolus angularis Wight)叶肉原生质体分离，培养与绿苗分化。豆科植物的原生质体培养是具重要经济价值的豆类作物遗传操作的重要手段，它在植物基因工程遗传转化受体系统方面的应用，以及在细胞融合，体细胞变异的选择利用等研究方面已显示出巨大潜力。但据1986年报导，豆科植物从原生质体再生植株仅限于苜蓿、车轴草、胡芦巴等少数种类。至于籽粒用豆科植物原生质体培养成苗的研究工作至今未见报道。本专利技术在赤豆原生质体分离、培养、愈伤组织形成及绿苗分化上的成功，是籽粒用豆科植物原生质体培养的一个突破。从赤豆叶肉原生质体培养至绿苗分化的过程中，对于被酶解后分离出来的原生质体进行培养是关键的一环。本专利技术在原生质体培养基中采用0.5-0.65M浓度的葡萄糖作为碳源和渗透压稳定剂。众所周知，试验材料的生理状况是影响豆科植物原生质体培养能否取得成功的重要因素。本专利技术采用接种11-16天的赤豆无菌苗真叶为游离原生质体材料，具有取材方便，材料生长旺盛等特点。本专利技术采用的酶解液成份是与含量是CaCl2·2H2O，1480.0mg/L;KH2PO4，27.2mg/L;KNO3，101.0mg/L;MgSO4·7H2O，246mg/L;CuSO4·5H2O，0.025mg/L;KI，0.16mg/L;Mannitol，130g/L，并在其中加入0.5%-1%(W/V)的纤维素酶和0.5%-1%(W/V)的半纤维素酶，该混合酶液经12-16小时，在25℃-27℃的温度条件下振荡酶解。酶解完成后用400目镍丝网过滤酶解液，可得产率高，活力强的原生质体。本专利技术提出一种适合于赤豆叶肉原生质体培养的基本培养基成份。其中无机盐成份中含有600-1000mg/L的CaCl2·2H2O，1200-1500mg/L的KNO3，200-300mg/L的NH4NO3，60-90mg/L的KH2PO4，600-900mg/L的MgSO4。与常用的MS培养基(见Murashige，T.and Skoog，F.，1962，Physiol.Plant，15473-497.)相应的成份与用量相比，本专利技术的培养基的无机氮源含量低，KH2PO4含量亦较低，但MgSO4·7H2O含量明显增加。基本培养基的维生素成份中含有0.02-0.08mg/L生物素，0.1-0.8mg/L叶酸，100-200mg/L的肌醇，3.0-3.5mg/L的盐酸硫胺素，0.5-0.8mg/L的盐酸吡哆素，1.0-2.0mg/L的甘氨酸，3.0-4.0mg/L的烟酸。与上述MS培养基相比，除甘氨酸以外，各种维生素含量都有了提高，而且增加了生物素与叶酸二类物质。试验结果表明，使用增加维生素，增加镁离子含量，降低无机氮源浓度的培养基成份，原生质体植板率可以达到5.5%。本专利技术以0.5-0.65M葡萄糖作为唯一碳源和渗透压稳定剂。这一条件最适合赤豆原生质体的生长，分裂和愈伤组织形成。采用不同糖的种类，并改变各种糖的使用浓度，试验结果差别很大，其中以葡萄糖作为唯一的碳源和渗透压稳定剂最适合赤豆原生质体的生长和分裂。不同浓度的葡萄糖也影响到试验结果，采用0.5-0.65M浓度的葡萄糖时，原生质体再生细胞的生长状态正常、分裂也旺盛。低于0.5M时，生长状态明显下降，植板率为0;而高于0.65M浓度时，再生细胞就极少分裂或不分裂。若以蔗糖作碳源，甘露醇作渗透压稳定剂，同样是0.5-0.6M浓度的糖，再生细胞的生长状态均见下降，前者未见分裂，后者极少分裂。因此从试验结果可以看出，蔗糖或是甘露醇对于赤豆叶肉原生质体的生长和分裂似有某种程度的抑制作用。细胞分裂素和生长素是豆科作物原生质体培养基中两类特别重要的化合物，是诱导再生细胞分裂，和形成愈伤组织所需要的。本专利技术原生质体培养基激素成份中含有2，4-二氯苯氧乙酸，α-萘乙酸，6-苄氨基嘌呤和王米素，上述植物激素的用量各为0.3-1mg/L。细胞分裂素与生长素的共同使用能促进良好的再生细胞生长，而将细胞分裂素或生长素单独使用时，再生细胞生长状态较差。本专利技术原生质体诱导愈伤组织扩增培养基中含有0.2-0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤，1-3mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸，愈伤组织每10-15天转接一次。采用本专利技术方法，愈伤组织扩增快，能长时期保存，并具潜在分化能力。本专利技术愈伤组织分化培养基的植物激素成份中含有1-5mg/L的6-苄氨基嘌呤。采用本专利技术方法并结合先短周期后长周期转接的培养方法，愈伤组织进一步呈分化能力很强的颗粒化。经96天转化培养，便可由愈伤组织诱导分化成绿苗。在长波长(500nm-700nm)生长灯光照下，绿苗分化周期短，且频率高。参考文献〔1〕Li，X.H.，1981，Theor.Appl.Genet.，60345-347.〔2〕Murashige，T.and Skoog，F.，1962，Physiol.Plant，15473-497。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从赤豆无菌苗游离和培养叶肉原生质体的方法，其特征是原生质体培养基成份中采用０．５至０．６５Ｍ浓度的葡萄糖作为碳源和渗透压稳定剂，原生质体分裂形成愈伤组织，再扩增，分化成绿苗。

【技术特征摘要】
1.一种从赤豆无菌苗游离和培养叶肉原生质体的方法，其特征是原生质体培养基成份中采用0.5至0.65M浓度的葡萄糖作为碳源和渗透压稳定剂，原生质体分裂形成愈伤组织，再扩增，分化成绿苗。2.按照权利要求1所述的原生质体培养基，其特征是培养基的无机盐成份中含有600-1000mg/L的CaCl2·2H2O，1200-1500mg/L的KNO3，200-300mg/L的NH4NO3，60-90mg/L的KH2PO4，600-900mg/L的MgSO4。3.按照权利要求1所述的原生质体培养基，其特征是培养基的维生素成份中含有0.02-0.08mg/L的生物素，0.1-0.8mg/L的叶酸，100-200mg/L的肌醇，3.0-3.5mg/L的盐酸硫胺素，0.5-0.8mg/L的盐酸吡哆素，1.0-2.0mg/L的甘氨酸，3.0-4.0mg/L的烟酸。4.按照权利要求1所述的原生质体培养基，其特征是培养基的植物激素成份中含有2，4-二氯苯氧乙酸，α-萘乙酸，6-苄氨基嘌呤和玉米素，上述植物激...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛扣麟，王韫珠，袁勋梅，黄培铭，杨金水，聂志平，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]