一种牡丹原生质体的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种牡丹原生质体的提取方法，首先诱导牡丹种子萌发，取5-10天的子叶和/或下胚轴，培养愈伤组织，培养过程中采用变温培养，即每天在0-10℃条件下暗培养8-10小时，在15-30℃条件下光照培养14-16小时；然后用酶液从愈伤组织中游离原生质体，再分离、提纯得到牡丹原生质体。本发明专利技术牡丹原生质体的提取方法，对牡丹种子的萌发及愈伤组织的培养采用变温培养，时常变温使组织细胞在冷热交替的刺激下，变得疏松易分散，有利于原生质体在游离过程中保持较高的活力，得到高活力的牡丹原生质体，最终提取得到的牡丹原生质体经染色法鉴别其活力在85%以上，适合采用突变、转基因和细胞融合等遗传操作诱导新品种。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
１．一种牡丹原生质体的提取方法，其特征在于：其步骤如下：１）取胚已进入成熟期的牡丹种子，酒精浸泡、灭菌，接种在ｐＨ为４．８－６．５的ＭＳ培养基中，诱导牡丹成熟胚萌发；２）取步骤１）萌发５－１０天的子叶和／或下胚轴，切碎，接入ｐＨ为４．８－６．５的ＭＳ培养基中，变温培养连续继代两次以上，获得愈伤组织，所述变温培养即每天在０－１０℃条件下暗培养８－１０小时，在１５－３０℃条件下光照培养１４－１６小时；３）取步骤２）得到的愈伤组织，置于ｐＨ为４．８－６．５的酶液中１８－２８℃震荡１２－１６小时游离原生质体，４）将游离原生质体后的酶液用１００－８００目滤网过滤，滤液离心弃上清液，加入ＣａＣｌ２洗液混匀，然后从溶液底部注入蔗糖溶液，离心取得处于中间部分的牡丹原生质体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张改娜，孔祥生，江志华，史国安，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：41