一种小菜蛾胚胎细胞系的培养方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种小菜蛾胚胎细胞系的培养方法及其应用，该培养方法包括以下步骤：取小菜蛾胚胎期的蛾卵，消毒处理后，破碎，过筛，获得小菜蛾的胚胎细胞；将所述胚胎细胞置于细胞培养基中，进行原代培养和传代培养，获得所述小菜蛾胚胎细胞系。本发明专利技术采用小菜蛾胚胎期的蛾卵进行原代培养和传代培养，获得的小菜蛾胚胎细胞系，能够应用于判断不同药剂对小菜蛾毒性的高低，实现药剂的筛选，简化了现有药剂筛选的步骤，降低了药剂筛选的假阳性率。

Culture method and application of Plutella xylostella embryo cell line

The invention discloses a method for culturing a diamondback moth embryo cell line and its application, the training method comprises the following steps: Taking diamondback moth embryonic moth eggs, after disinfection, crushing, sieving, obtained the diamondback moth embryo cells; the embryonic cells in cell culture medium for primary culture and passaging, obtain the diamondback moth embryo cell line. The invention adopts the diamondback moth eggs embryos were cultured and subcultured in diamondback moth embryo cell line obtained, can be applied to determine the level of different chemicals on diamondback moth toxicity, filtering agents, simplify the steps of existing pharmaceutical screening, drug screening reduces the false positive rate.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种小菜蛾胚胎细胞系的培养方法及其应用。
技术介绍
小菜蛾(Plutella xylostella)属鳞翅目、菜蛾科，是世界性的十字花科蔬菜的主要害虫之一，目前已广泛分布于亚洲、欧洲，美洲、非洲、大洋洲，其造成的经济损失由于其发生范围的扩大和发生频率的增高而日益增大。小菜蛾已成为世界范围内十字花科蔬菜生产的重大障碍(Bai，S.F.，Chen，X.X.，Cheng，J.A.，Fu，W.J.，He，J.H.，2002.Characterization of Cotesia plutellae polydna virus and its physio logical effects on the diamondback moth，Plutella xylostella larvae.Acta Entomologica Sinica 46，401-408.Bai，S.F.，Chen，X.X.，Cheng，J.A.，Fu，W.J.，He，J.H.，2005.Plutellae on growth and development of Plutella xylostella larvae.Acta Phytophylacica Sinica32，235-240.)。在我国，小菜蛾的危害日趋严重，目前对小菜蛾的防治仍以化学防治为主，从20世纪50年代开始，小菜蛾对市售化学农药产生抗性的研究报道不断出现。据报道，小菜蛾已对氰戊菊酯、敌敌畏、辛硫磷、杀虫单、抑太保等50多种杀虫剂产生了程度不同的抗性，其中包括生物源农药阿维菌素(周小毛，柏连阳，黄雄英，吴青君.小菜蛾对阿维菌素的抗药性研究进展[J].江西农业学报，2007，03：48-50+53)。防治小菜蛾药剂的常规筛选方法主要是：点滴法和浸渍法，即将稀释后的杀虫剂药液点滴于小菜蛾幼虫胸部背面或将幼虫放入浸虫器内浸渍3s，然后在培养箱内继续饲养，通过观察并计算小菜蛾死亡率等数据，得到药剂的防治效果。这种活体筛选方法受养虫周期长、虫源一致性差和外界条件影响大等因素的影响，使得筛选效率低，重复性差。另外，该方法对化合物样品的需要量大，不能满足化合物的大量筛选；而且供试昆虫的室内饲养，又需要占据空间耗费一定的人力和物力。所以，新型的药剂筛选方法成为防止小菜蛾危害的首要任务。目前新型的药剂筛选方法主要是利用MTT法测定药剂对昆虫细胞系的毒力。药剂对细胞系的毒力测试，在严格控制的实验条件下，简化影响因素，更直接地从细胞水平上反映了毒力的差异。但是由于杀虫剂种类繁多，靶细胞复杂多样，在单一细胞制备的细胞系中因找不到靶作用位点而毒力降低，甚至表现出无毒等假阴性的结果。因此，利用细胞系进行药剂筛选这种方法虽然简单快捷，但对供试昆虫对细胞系的要求较高。目前，小菜蛾已有的细胞系BCIRL-PX2-HNU3是利用小菜蛾蛹发展起来的细胞系，昆虫蛹期的细胞和组织会转变为成虫期所特有的器官，在细胞组成上与幼虫期这一重要危害期的偏差太大，不适宜用于药剂筛选。因此，建立一种新的小菜蛾细胞系用来药剂的筛选已经成为小菜蛾防治现阶段的重要任务。
技术实现思路
本专利技术提供了一种小菜蛾胚胎细胞系的培养方法及其应用，该方法制备获得的小菜蛾胚胎细胞系能够应用于判断不同药剂对小菜蛾毒性的高低，实现药剂的筛选，简化了现有药剂筛选的步骤，降低了药剂筛选的假阳性率。一种小菜蛾胚胎细胞系的培养方法，包括以下步骤：(1)取小菜蛾胚胎期的蛾卵，消毒处理后，破碎，过筛，获得小菜蛾的胚胎细胞；(2)将所述胚胎细胞置于细胞培养基中，进行原代培养和传代培养，获得所述小菜蛾胚胎细胞系。如
技术介绍
中所述，现有的小菜蛾细胞系仅为BCIRL-PX2-HNU3，其利用的是小菜蛾蛹培养获得的，因在细胞组成上与幼虫期偏差较大，所以不适宜药剂筛选；而经试验发现，采用小菜蛾胚胎期的蛾卵能够很好地解决上述问题，且检测准确率高。作为优选，所述蛾卵为小菜蛾产卵后15～24h内的卵；若所取蛾卵超过这一时间段，则很难培育出本专利技术所需的小菜蛾胚胎细胞系。消毒时间过短，则无法达到消毒目的；而时间过长，又会造成卵的严重失水。作为优选，所述消毒处理的过程为：酒精浸泡蛾卵8～10min，进行表面消毒；再依次用无菌水、无血清培养基清洗2～3次作为优选，步骤(1)中，所述过筛的目数为100目；可将大的细胞团过滤掉，而不影响小的细胞。作为优选，所述原代培养和传代培养的温度为25-29℃。在TNM-FH培养基中，添加一定用量的胎牛血清能够在细胞脆弱的初期，提供丰富的营养，这对原代培养是必须的。所述原代培养的细胞培养基含有TNM-FH培养基和胎牛血清；其中，胎牛血清占TNM-FH培养基质量的15～25％。另外，原代培养过程中，细胞培养基中不添加体积分数为1％的抗生素(占TNM-FH培养基体积的百分数)。因为抗生素虽然毒害作用很小，但是对于原代细胞来说是很严重的伤害。为更好地节约细胞培养成本，降低胎牛血清用量。作为优选，所述传代培养的细胞培养基，在细胞培养1～5代时，胎牛血清占TNM-FH培养基质量的20％；在细胞培养6-17代时，胎牛血清占TNM-FH培养基质量的15％；在细胞培养18代后，胎牛血清占TNM-FH培养基质量的15％。本专利技术还提供了所述的培养方法获得的小菜蛾胚胎细胞系。本专利技术还提供了所述小菜蛾胚胎细胞系在防治小菜蛾的药剂毒力筛选中的应用。具体地，所述的应用，包括：(1)取甲醇溶解后的药剂，加入至小菜蛾胚胎细胞系中，再加入WST-1细胞毒性检测试剂盒，共培养后，获得待检测的样品；(2)测定样品OD450的值，计算获得细胞死亡率。本专利技术小菜蛾胚胎细胞系适用于有机氯类、有机磷类、拟除虫菊脂类、氨基甲酸脂类、有机硫类、酚类、酸类、醚类、苯氧羧酸类、脲类、磺酰脲类、三氮苯类、脒类、有机金属类药剂的筛选。作为优选，所述药剂为有机磷类药剂或拟除虫菊脂类药剂；更优选，所述药剂为氯氰菊酯、联苯菊酯、杀螟硫磷中的一种。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术采用小菜蛾胚胎期的蛾卵进行原代培养和传代培养，获得的小菜蛾胚胎细胞系，能够应用于判断不同药剂对小菜蛾毒性的高低，实现药剂的筛选，简化了现有药剂筛选的步骤，降低了药剂筛选的假阳性率。(2)本专利技术利用WST-1法测定药剂对小菜蛾胚胎细胞系进行毒力测定，不仅实验周期短，结果稳定可靠，同时WST-1可以与细胞共培养，相较于MTT法简化了操作步骤，使得大量筛选新药剂防治小菜蛾成为可能。(3)本专利技术小菜蛾胚胎细胞系稳定传代后，培养条件宽松，对操作人员要求低，易上手。附图说明图1为实施例2中不同浓度的高效氯氰菊酯对小菜蛾卵细胞死亡率的影响；图2为实施例2中不同浓度的联苯菊酯对小菜蛾卵细胞死亡率的影响；图3为实施例2中不同浓度的杀螟硫磷对小菜蛾卵细胞死亡率的影响。具体实施方式下列实施例中采用的TNM-FH培养基购买SIGMA公司，型号T3285。实施例1小菜蛾胚胎细胞系的制备小菜蛾胚胎细胞系培养方法，具体步骤如下：1、取200-300粒小菜蛾产卵后15～24h内处在胚胎期的健康的小菜蛾卵；2、用质量分数为75％的酒精浸泡卵8～10min，进行表面消毒；然后用无菌水清洗2次，随后用无血清培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小菜蛾胚胎细胞系的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取小菜蛾胚胎期的蛾卵，消毒处理后，破碎，过筛，获得小菜蛾的胚胎细胞；(2)将所述胚胎细胞置于细胞培养基中，进行原代培养和传代培养，获得所述小菜蛾胚胎细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种小菜蛾胚胎细胞系的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取小菜蛾胚胎期的蛾卵，消毒处理后，破碎，过筛，获得小菜蛾的胚胎细胞；(2)将所述胚胎细胞置于细胞培养基中，进行原代培养和传代培养，获得所述小菜蛾胚胎细胞系。2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述蛾卵为小菜蛾产卵后15～24h内的卵。3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过筛的目数为100目。4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述原代培养和传代培养的温度为25-29℃。5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述原代培养的细胞培养基含有TNM-FH培养基和胎牛血清；其中，胎牛血清占TNM-FH培养基质量的20～25％。6.如权利要求1所述的培养方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈学新，王泽华，时敏，邹佳妮，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33