一种利用不含透明带的囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用不含透明带的囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，具体地，本发明专利技术提供了一种体外非治疗性的利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，包括步骤：(a)提供一来自囊胚培养体系的培养液，其中，所述囊胚培养体系中的胚胎在培养前已去除透明带，所述胚胎在所述囊胚培养体系中培养3‑6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出所述培养液；(b)对所述培养液进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。本发明专利技术提供的方法可去除IVF和ICSI技术过程中多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险，并可精确的鉴定胚胎染色体是否异常。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学和分子细胞生物学领域，具体地，涉及一种利用不含透明带的囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法。
技术介绍
辅助生殖技术已经成为治疗不孕不育的重要手段，随着技术水平的不断提高，辅助生殖的临床妊娠率也不断升高，但是胚胎种植率并没有显著性升高。胚胎的质量是影响胚胎种植的主要因素，目前优质胚胎的选择主要通过胚胎发育形态学评分，主观性较大并不能从根本上区分胚胎质量好坏。有研究表明即使是一些形态良好的优质囊胚是非整倍体，或者染色体整倍体胚胎它的形态学评分并不高。因此仅仅依靠胚胎形态学评价并不能保证移植的胚胎染色体是正常的。大量研究表明体外受精来源的胚胎有相当部分是染色体非整倍体，尤其是来自高龄不孕女性的胚胎。移植非整倍体胚胎导致移植后着床失败或流产，也是目前试管婴儿成功低的主要原因。应用胚胎植入前遗传学筛查(Pre-implementation Genetic Screen，PGS)选择染色正常的胚胎，能够有效提高试管婴儿胚胎种植成功率，同时降低妊娠流产率。然而PGS检测需对胚胎进行活检，从胚胎中取出1至数个细胞进行检测，存在胚胎损伤风险。而目前的利用囊胚培养液检查胚胎染色体的方法也存在着IVF和ICSI技术过程中多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险。在IVF技术过程中，数亿条精子与一个卵子在体外人工培养环境中混合。其结果是有多条精子同时卵子结合，虽然只有一条精子与卵子完成正常受精，其他无法完成受精的多余精子仍滞留在卵细胞外周的透明带中。另外，此时也会有大量母体来源的颗粒细胞粘附在卵子外周的透明带上。这些滞留在透明带中的多余精子和粘附在透明带表面的颗粒细胞在受精卵体外培养，发育成囊胚的过程中可能将DNA释放到培养液中，因此囊胚培养液中的DNA容易受到精子和颗粒细胞DNA的污染。在ICSI技术过程中，将单个精子注射入卵子的技术方法避免了多余精子对囊胚培养液的污染。但卵子透明带上粘附的母体来源的颗粒细胞仍然会对对囊胚培养造成污染并对后续检测形成干扰。因此，本领域迫切需要开发一种既可去除IVF和ICSI技术过程中多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险，又能精确的鉴定胚胎染色体是否异常的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种既可去除IVF和ICSI技术过程中多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险，又能精确的鉴定胚胎染色体是否异常的方法。本专利技术的第一方面提供了一种体外利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，包括步骤：(a)提供一来自囊胚培养体系的培养液，其中，所述囊胚培养体系中的胚胎在培养前已去除透明带，所述胚胎在所述囊胚培养体系中培养3-6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出所述培养液；(b)对所述培养液进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。在另一优选例中，所述囊胚培养体系中仅含有一个胚胎。在另一优选例中，所述囊胚培养体系为单胚胎培养体系，并且在所述单胚胎培养体系中没有透明带，含有10-100微升，较佳地，15-50微升，更佳地，20-35微升的培养液。在另一优选例中，所述步骤(a)中分离出的培养液的体积为所述单胚胎培养体系中培养液体积的30-100％，较佳地，40-100％，更佳地，50-100％，最佳地，80-100％。在另一优选例中，所述步骤(b)中还包括步骤(c)：(i)将所述培养液与裂解液混合，从而获得含有所述培养液与裂解液的第一混合物；(ii)将所述第一混合物与裂解酶混合，孵育，失活裂解酶，从而获得裂解产物；和(iii)对所述裂解产物进行基因组分析，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。在另一优选例中，所述基因组分析的方法选自下组：二代测序、核酸芯片、免疫荧光检测、荧光PCR检测、一代测序、三代测序、质谱检测、或其组合。在另一优选例中，所述裂解液选自下组：Tris缓冲液、螯合剂、盐酸盐、非离子型表面活性剂、或其组合。在另一优选例中，所述Tris缓冲液包括Tris-Cl。在另一优选例中，所述Tris缓冲液的浓度为10-60mM，较佳地，15-50mM，更佳地，20-40mM。在另一优选例中，所述Tris缓冲液的pH为5-10，较佳地，6-9，更佳地，7-8。在另一优选例中，所述螯合剂包括EDTA。在另一优选例中，所述螯合剂的浓度为0.2-8mM，较佳地，0.5-6mM，更佳地，1-4mM。在另一优选例中，所述盐酸盐选自下组：KCl、NaCl、或其组合。在另一优选例中，所述盐酸盐的浓度为5-60mM，较佳地，8-40nM，更佳地，10-40mM。在另一优选例中，所述非离子型表面活性剂选自下组：Triton X-100、Triton X-114、吐温20、NP40、SDS、或其组合。在另一优选例中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.02-10％，较佳地，0.05-5％，更佳地，0.1-3％，以所述裂解液的总重计。在另一优选例中，所述步骤(i)中，培养液与裂解液的体积比为1：10－10：1，较佳地，1：5－5：1，更佳地，1：2—2：1。在另一优选例中，所述裂解酶选自下组：蛋白酶K、Qiagen Protease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、或其组合。在另一优选例中，所述裂解酶的浓度为1-25μg/ml，较佳地，5-20μg/ml，更佳地，10-15μg/ml。在另一优选例中，所述裂解酶的添加量为0.1-10μl，较佳地，0.5-6μl，更佳地，0.8-3μl。在另一优选例中，所述步骤(c)包括选自下组的一个或多个特征：(i)孵育温度为20-70℃，较佳地，30-60℃；(ii)孵育时间为1min－12h，较佳地，10min－6h，更佳地，30min－2h；(iii)失活温度为60-100℃，较佳地，75-95℃；(iv)失活时间为0.5-20min，较佳地，10-15min；在另一优选例中，所述培养液用如下方法获得：(i)培养受精卵胚胎至3-6天(较佳地，4天)后，去除所述胚胎的透明带，从而获得不含透明带的胚胎；(ii)将步骤(i)的不含透明带的胚胎转移到囊胚培养微滴中培养0.5-3天(较佳地，1－2天)，从而获得含有囊胚的培养液；和(iii)分离步骤(ii)中获得的培养液，即为用于鉴定所述胚胎染色体是否异常的培养液。在另一优选例中，所述囊胚培养微滴的体积为10-100微升，较佳地，15-50微升，更佳地，20－35微升。在另一优选例中，所述方法为非治疗和非诊断性的。本专利技术第二方面提供了一种制备基因检测样本或染色体检测样本的方法，包括步骤：(i)提供一培养体系，所述培养体系中含有去除透明带的胚胎，培养3-6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出液体，即为所述检测样本。在另一优选例中，所述方法还包括步骤(ii)：对获得的所述检测样本进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。在另一优选例中，所述培养体系中仅含有一个胚胎。在另一优选例中，所述培养体系为单胚胎培养体系，含有10-100微升，较佳地，15-50微升，更佳地，20－35微升的培养液。在另一优选例中，步骤(ii)中，所述检测样本的体积为所述培养体系中培养液体积的30-100％，较佳地，40-100％，更佳地，50-100％，最佳地，80-100％。在另一优选例中，在步骤(ii)中，对所述检测样本进行离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外非治疗性的利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供一来自囊胚培养体系的培养液，其中，所述囊胚培养体系中的胚胎在培养前已去除透明带，所述胚胎在所述囊胚培养体系中培养3‑6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出所述培养液；(b)对所述培养液进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。

【技术特征摘要】
1.一种体外非治疗性的利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供一来自囊胚培养体系的培养液，其中，所述囊胚培养体系中的胚胎在培养前已去除透明带，所述胚胎在所述囊胚培养体系中培养3-6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出所述培养液；(b)对所述培养液进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊胚培养体系为单胚胎培养体系，并且在所述单胚胎培养体系中没有透明带，含有10-100微升，较佳地，15-50微升，更佳地，20-35微升的培养液。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中分离出的培养液的体积为所述单胚胎培养体系中培养液体积的30-100％，较佳地，40-100％，更佳地，50-100％，最佳地，80-100％。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中还包括步骤(c)：(i)将所述培养液与裂解液混合，从而获得含有所述培养液与裂解液的第一混合物；(ii)将所述第一混合物与裂解酶混合，孵育，失活裂解酶，从而获得裂解产物；和(iii)对所述裂解...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆思嘉，蔡立义，任军，马婷，方锐，
申请(专利权)人：上海序康医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31