本发明专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及一种检测乳糖酶基因多样性的引物组及其应用，所述引物组的序列包括：上游引物SEQ ID NO.1与下游引物SEQ ID NO.2、上游引物SEQ ID NO.3与下游引物SEQ ID NO.4和上游引物SEQ ID NO.5与下游引物SEQ ID NO.6。本发明专利技术通过设计广谱兼并引物得到引物组，通过该引物组扩增乳糖酶基因片段，可鉴定微生物菌落多样性，以便了解其微生物种类和丰度组成，进而研究物种进化和系统发育，从而帮助医学研究者更好的指导用药。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及一种乳糖酶基因的引物组及其应用。
技术介绍
乳糖酶(1actase)又称β-D-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23,β-D-galactosedase)，水解乳糖成葡萄糖和半乳糖被人或动物利用。乳糖代谢障碍可引起人和动物的一系列疾病。机体一旦出现乳糖酶缺乏、含量低或活性差，乳糖将不能被水解和吸收，直接到达小肠下段和结肠，在肠道细菌的作用下产生短链脂肪酸、CO2和CH4等低分子物质，其高渗作用使肠道内水分增加，出现腹胀、腹痛和腹泻等临床症状，称为乳糖不耐受(lactose intolerance,LI)。腹泻是肠道疾病最常见的一种症状。目前认为感染性腹泻、抗生素相关性腹泻(antibiotic associated diarrhea,AAD)、迁延性腹泻和乳糖酶缺乏性腹泻等都与乳糖酶活性低有关。细菌、病毒的侵袭导致小肠上皮细胞损伤，出现绒毛脱落、数量减少和排列混乱等现象，使绒毛上分泌的乳糖酶减少、活性降低，导致腹泻。多种腹泻可以通过补充乳酸菌或乳糖酶来进行治疗。抗生素影响肠道粘膜的快速再生，使肠粘膜刷状缘的乳糖酶受损、活性下降，从而导致腹泻。可见，乳糖酶是腹泻相关的重要肠道功能酶。微生物是产乳糖酶的主要来源，包括细菌、霉菌、酵母菌和放线菌，其中细菌占绝大多数,如细菌中的乳酸菌(Lactobacillus sp)、双歧杆菌(Bifidobacterium sp)、芽孢杆菌(Bacillus sp)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等均产乳糖酶。目前，常用于工业生产的细菌、酵母以及真菌的乳糖酶基因均己被克隆，这些乳糖酶基因虽然来源不同，但它们之间却具有一定的同源性。克隆最多的是细菌来源的乳糖酶基因，通常这些基因之间的同源性较高，与酶的催化活性相关的区域保守性强。公开的文献中针对乳糖酶研究的主要聚中在针对某种微生物的乳糖酶扩增和克隆，如章沙沙等通过设计简并引物从乳杆菌Lactobacillus sp.B164中克隆得到一个乳糖酶基因b942—164，该方法只针对一种乳杆菌进行扩增；刘爱兵等通过设计引物以乳酸克鲁维斯醉母(Kluyveromycesla ctis)菌株k538的基因组DNA为模板，利用PCR获得乳糖酶基因Klac；燕艳等对从新疆火焰山土壤中筛选出的菌株Huob的乳糖酶基因进行扩增、克隆和鉴定，发现其与巨大芽孢杆菌乳糖酶相似性为99％；王政等通过引物设计软件进行引物的设计，成功地从保加利亚乳杆菌中扩增出全长乳糖酶基因片段等等，以上文献目前采用的方法都是通过设计引物，从某一种产乳糖酶基因的微生物中扩增出乳糖酶基因，用于克隆鉴定，而目前通过设计广谱性的兼并引物同时扩增出众多微生物的乳糖酶基因，进而进行乳糖酶基因多样性的研究，还没有文献涉及。因为传统的研究肠道微生物种群结构的方法是通过微生物分离培养方法来实现的，这样会导致微生物多样性信息的严重丢失：只可了解可培养微生物，对不可培养微生物则完全不了解。因此能够同时对肠道中所有产乳糖酶的微生物种群结构进行鉴定，将会帮助研究者更多的了解产乳糖酶微生物，从而知道医学研究者更好的用药。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过设计广谱兼并引物，通过该引物扩增乳糖酶基因片段，将所有微生物(包括可培养和不可培养)进行菌落多样性鉴定，从而了解其菌种进化和系统发育，从而帮助医学研究者更好的指导用药。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种检测乳糖酶基因多样性的引物组，所述引物组的序列包括：上游引物SEQ ID NO.1与下游引物SEQ ID NO.2、上游引物SEQ ID NO.3与下游引物SEQ ID NO.4和上游引物SEQ ID NO.5与下游引物SEQ ID NO.6；所述SEQ ID NO.1所示的上游引物的核苷酸序列如下：GACTAYAAYCCGGAVCAGTGG；所述SEQ ID NO.2所示的下游引物的核苷酸序列如下：TATTCRTTGGARATATGCCA；所述SEQ ID NO.3所示的上游引物的核苷酸序列如下：CCGYTSACCACSAAYTTCATGGT；所述SEQ ID NO.4所示的下游引物的核苷酸序列如下：GCBGAGGTGGADTGYTCCAT；所述SEQ ID NO.5所示的上游引物的核苷酸序列如下：TRRGCAACGAATACGGSTG；所述SEQ ID NO.6所示的下游引物的核苷酸序列如下：ACCATGAARTTSGTGGTSARCGG。其中，引物中的Y,V,R,S为简并引物。本专利技术中，所述SEQ ID NO.1-2这对引物能扩增出350-450bp的乳糖酶基因，所述SEQ ID NO.3-4这对引物能扩增出150-250bp的乳糖酶基因，所述SEQ ID NO.5-6这对引物能扩增出300-350bp的乳糖酶基因。本专利技术中，所述引物组可以扩增乳糖酶基因片段，将扩增后的片段进行生物信息学分析，可鉴定微生物菌落多样性，以便了解其微生物种类和丰度组成，进而研究物种进化和系统发育，有助于后期的治疗用药。第二方面，本专利技术提供一种检测乳糖酶基因多样性的反应体系，所述反应体系包括第一方面所述的引物组，缓冲液，dNTPs，Q5高保真DNA聚合酶，待检样品基因组DNA和去离子水。优选地，所述反应体系中每25μL反应体系含有以下组分：第三方面，本专利技术提供一种利用如第一方面所述的引物组或如第二方面所述的反应体系检测乳糖酶基因多样性的方法，包括以下步骤：(1)以SEQ ID NO.1-6所示的序列为引物，对待检测样本进行扩增，得到乳糖酶基因片段；(2)将步骤(1)扩增得到的基因片段进行文库构建、文库质检及测序；(3)将步骤(2)测序的数据进行质量初筛，并进行生物信息学分析。优选地，步骤(1)所述的待测样本选自但不限于含有微生物菌群的肠道微生态样品、生殖道微生态样品、口腔与呼吸道样品、皮肤微生物样品、食品微生物样品、土壤类样品、水体类样品、污泥类样品或生物膜样品中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述含有微生物菌群的肠道微生态样品选自但不限于粪便、肠道粘膜或肠道内容物中的任意一种或至少两种的组合。优选地，步骤(1)所述的扩增条件为：(a)98℃预变性30s，1循环；(b)98℃变性15s、46-63.2℃退火30s、72℃延伸30s，25-32个循环；(c)72℃延伸5min，1循环；(d)4℃保存。优选地，步骤(1)所述的扩增条件为：(a)98℃预变性30s，1循环；(b)98℃变性15s、46℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；(c)72℃延伸5min，1循环；(d)4℃保存。所述文库构建为：利用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒对PCR产物在酶标仪上进行定量，然后按照每个样品所需的数据量进行混样，利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT文库制备试剂盒进行建库；具体步骤如下：1)末端修复：(1)取30ng混好的DNA片段补水至60μL，加入40μL末端修复缓冲液2；(2)用枪吹打混匀，并置于PCR仪上本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测乳糖酶基因多样性的引物组，其特征在于，所述引物组的序列包括：上游引物SEQ ID NO.1与下游引物SEQ ID NO.2、上游引物SEQ ID NO.3与下游引物SEQ ID NO.4和上游引物SEQ ID NO.5与下游引物SEQ ID NO.6。
【技术特征摘要】
1.一种检测乳糖酶基因多样性的引物组，其特征在于，所述引物组的序列包括：上游引物SEQ ID NO.1与下游引物SEQ ID NO.2、上游引物SEQ ID NO.3与下游引物SEQ ID NO.4和上游引物SEQ ID NO.5与下游引物SEQ ID NO.6。2.一种检测乳糖酶基因多样性的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括权利要求1所述的引物组，缓冲液，dNTPs，Q5高保真DNA聚合酶，待检样品基因组DNA和去离子水。3.根据权利要求2所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系中每25μL反应体系含有以下组分：。4.一种利用如权利要求1所述的引物组或如权利要求2或3所述的反应体系检测乳糖酶基因多样性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以SEQ ID NO.1-6所示的序列为引物，对待检测样本进行扩增，得到乳糖酶基因片段；(2)将步骤(1)扩增得到的基因片段进行文库构建、文库质检及测序；(3)将步骤(2)测序的数据进行质量初筛，并进行生物信息学分析。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的待测样本为含有微生物菌群的肠道微生态样品、生殖...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙子奎，王锋，丁方美，李嫦娥，王慧娟，
申请(专利权)人：上海派森诺生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。