染色体异常的产前诊断方法技术

染色体异常是造成大量出生缺陷（包括精神发育迟缓）的主要原因。本发明专利技术涉及基于对母亲血样的分析，无创性快速产前诊断染色体异常的方法。本发明专利技术利用母亲和胎儿之间ＤＮＡ的差异，例如其甲基化状态的差异，作为富集母体血浆样本中的胎儿ＤＮＡ的方法。本发明专利技术所述方法可以用来检测染色体ＤＮＡ缺失和重复。在优选的实施方案中，所述方法用于诊断染色体非整倍性及相关疾病，例如唐氏综合征和特纳综合征。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及染色体异常的无创性产前诊断方法。本专利技术的方法可以用来检测染色体DNA缺失和重复。在优选的实施方案中，所述方法用于诊断染色体非整倍性及相关疾病，例如唐氏综合征(Down′s Syndrome)和特纳综合征(Turner′s Syndrome)。本专利技术还提供鉴定甲基多态性探针的方法，所述甲基多态性探针可用于检测胎儿染色体异常。
技术介绍
染色体异常是造成大量先天缺陷(包括精神发育迟缓)的主要原因。异常一般表现为染色体DNA重复和缺失，以及染色体非整倍性，后者指的是完整的染色体的异常存在或缺失。当生物体具有少于或多于正常二倍体的染色体数量时，就会产生大量异常特征并引起多种综合征。唐氏综合征，亦称21三体综合征，是染色体非整倍性最常见的例子，包括一条额外的21号染色体。其它常见的染色体非整倍性有13三体综合征、18三体综合征、特纳综合征和克兰费尔特综合征(Klinefelter′s Syndrome)。对于染色体异常产前检测的选择主要限于有创性方法，这些方法会有致使胎儿丢去的风险，虽小但的确有一些。最常用的检测异常的方法是羊膜穿刺术。然而，由于羊膜穿刺术是有创性方法，因此通常只用于高龄产妇，因为高龄产妇的胎儿出现染色体异常的风险有所增加。因此，建立用于胎儿染色体异常诊断的无创性方法非常有益，这些方法可以使众多的准妈妈受益。美国专利号4,874,693中已经描述了这样一种无创性方法，该专利公开了通过监测母亲的人绒毛膜促性腺激素(HCG)水平，检测胎盘机能障碍以显示染色体异常的方法。然而，虽然这种方法是无创性的并且能够用来筛选所有年龄段的准妈妈，但它不能作为具体染色体异常存在的诊断方法，也不能作为具体染色体异常存在的保证。现有的产前诊断方法除了取样步骤是有创性的，操作也耗时费力。例如，吉姆萨(Geisma)染色法是最广为使用的技术，这种方法要求实验时，细胞处于细胞分裂中期或者正在分裂。每对染色体要染上特征性的明带谱或暗带谱。采用这种方法，所有的染色体能够被一一区分并容易展现任何结构上的或数量上的异常性质。吉姆萨染色法不是总能检测出精细的染色体重排。如果怀疑染色体重排，但用这种方法检测不到，进一步的详细分析可以使用荧光原位杂交(FISH)或图谱核型分析(SKY)进行。用吉姆萨染色法，测试结果需要一到两周。SKY就是用不同探针(染料颜色)对每个中期染色体染色的技术。因为每个染色体特异性探针都会发射自身所特有的荧光波长，因此能够容易地观察到结构重排，并能够容易地鉴定所涉及的染色体。由于SKY要求细胞是处于细胞分裂中期的细胞，因此结果需要一到两周。FISH就是用荧光探针(染料)与特异性个别染色体或染色体的某些区结合或杂交的技术。受到影响的染色体或染色体区发荧光或是发出信号，可以通过荧光显微镜目测分析它们的存在或缺失。FISH通常用于鉴定具体的染色体重排或快速诊断出异常染色体存在的数量。对于异常染色体数量，FISH是目前最快的诊断异常染色体数量的方法。速度较快是因为分析用的细胞不必是处于细胞分裂中期的细胞。因此，一般2到3天就可以知道测试结果。因此，本领域需要无创性的产前诊断方法，这些方法能够快速而准确地帮助确定染色体畸变的存在和类型。专利技术概述本专利技术描述了用于染色体异常例如染色体非整倍性的无创性产前诊断方法，所述方法可以快速地做出准确的结果。本专利技术方法使用的是得自孕妇的血浆样本。已经显示出，除了母体血浆中有较小百分比的胎儿细胞外，母体样本还含有较小百分比的胎儿DNA。常染色体具有一个母亲遗传的等位基因(A，如下表所示)和一个来自父亲的等位基因(B，如下表所示)。有一种情况，其中胎儿DNA占母体血浆样本中存在的总DNA的约2％，胎儿等位基因的存在状况描述如下 因此，由于正常与三体之间的B％的差异仅仅是(2/200-2/202)即0.01％，因此这种差异太小了，即便采用现有最好的定量方法也难以发现。在检测样本中的等位基因之前，通过相对地富集母体血浆样本中的胎儿DNA数量，本专利技术就解决了这个难题。本专利技术利用母体和胎儿之间DNA中的差异，例如，DNA甲基化状态中的差异，富集母体血浆中的胎儿DNA以便准确地检测样本中的胎儿等位基因。因此，可以将母体DNA大体上缩减、掩蔽或完全破坏，样本余留的大部分DNA就是胎儿的了。可以用一种或多种酶选择性破坏母体DNA，例如甲基化敏感酶，这类酶可以选择性消化这个区域周围的母体核酸，稍后用来检测等位基因频率。然后使用靠近所选择的染色体区的多态性标记，测定胎儿DNA的等位基因频率。与对照样本比较，等位基因频率的差异表明存在染色体异常。在一个实施方案中，提供了检测染色体异常的方法，该方法包括a)获取孕妇血浆样本，b)任选地从所述血浆样本中分离DNA，c)用酶(例如甲基敏感酶)消化DNA，该甲基敏感酶选择性消化母体DNA或胎儿DNA，d)利用选择性消化以获得富集了胎儿DNA或母体DNA的DNA样本，e)用靠近所选胎儿DNA区的多态性标记测定母源或父源等位基因频率，f)将步骤e)的父源或母源等位基因频率与对照DNA样本进行比较，其中等位基因频率的差异表明存在染色体异常。优选，考虑到多态性差异，应当用一组正常DNA和/或异常DNA与推定异常DNA进行比较。因此，如果通过消化将母体DNA完全破坏，那么就能够检测到胎儿等位基因频率，如下表所示 因为相对富集了母体血浆样本中的胎儿DNA，所以现在几乎是采用任何核酸检测方法都可以准确地检测出等位基因频率。母体血浆样本中的母源等位基因与父源等位基因之比因此仅仅反映出胎儿中的等位基因比率。因此，如果样本中有两个以上的母源等位基因，那么这个比率将明显地不同于正常时的1/2。可以利用胎儿DNA和母体DNA之间的任何差异，例如利用Y染色体特异性DNA和端粒长度。母体和胎儿之间DNA的差异可以用已知的方法来测定。在差异是差异甲基化的情况下，甲基敏感酶消化未甲基化的母体DNA，而胎儿里的DNA是甲基化的，反之亦然。例如，当胎儿DNA区是甲基化的，那么将甲基敏感酶用来消化未甲基化的母体DNA。消化后只留下胎儿甲基化DNA片段，因此就富集了胎儿DNA。然后将靠近差异甲基化DNA区或在差异甲基化DNA区内的多态性标记用作检测母体血浆样本中的母源或父源DNA频率的标记。将母源DNA和父源DNA的等位基因频率和得自无染色体异常健康个体的基因组DNA中通常观察得到的等位基因频率进行比较。这样，就可以检测出任何染色体异常。因为能够同时检测出一个或多个等位基因，因此可从同一样本中同时筛选出多种染色体异常。或者说，只消化甲基化DNA的酶可以用来富集在胎儿中是未甲基化的而在母亲中是甲基化的DNA。本专利技术的方法适于检测染色体DNA重复或染色体DNA缺失，以及检测染色体非整倍性。尽管优选首先要大体上完全破坏母源等位基因时，但是这就没有必要。本专利技术也提供一种方法，该方法中如果母体DNA没有被完全破坏，就要一个或多个最好不是双份的染色体作对照等位基因。情况如下 表中，等位基因B和等位基因D是胎儿DNA中的父性遗传等位基因。或者，在首次消化后，胎儿DNA可以被进一步扩增。因此，本专利技术提供一种方法，该方法中在首次消化母体DNA后，采用选择性地扩增胎儿DNA的扩增方法扩增样本。或者说，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种预定ＤＮＡ区内的染色体异常的产前诊断方法，所述方法包括下述步骤：　　　　（ａ）获取孕妇血浆样本；　　　　（ｂ）用酶消化所述血浆样本中的ＤＮＡ，所述酶选择性和基本上完全消化母体ＤＮＡ，从而获得富集了胎儿ＤＮＡ区的ＤＮＡ样本；和　　　　（ｃ）用靠近步骤（ｂ）样本中的胎儿ＤＮＡ区或在该区内的多态性标记，测定父源或母源等位基因频率，　　　　其中与不包含染色体异常的正常对照相比，等位基因频率与５０％的父源等位基因和５０％的母源等位基因之间有差异，就表明有染色体异常。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：CR坎托尔，C丁，
申请(专利权)人：波士顿大学信托人，
类型：发明
国别省市：US[美国]