本发明专利技术公开了对索拉非尼具有耐药性或敏感性的人肝癌细胞系及其应用。对索拉非尼具有耐药性的人肝癌细胞系名称为LIXC-004-SR，其保藏编号为CCTCC NO:C2013181，对索拉非尼具有敏感性的细胞系名称为LIXC-004-NA，其保藏编号为CCTCC NO:C2013180。上述人肝癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代。其中LIXC-004-SR细胞系对肝癌的一线用药索拉非尼的体内治疗耐药，是首例对索拉非尼获得性体内治疗耐药的肝癌细胞模型，也是获得性的肿瘤血管生成增加的罕见肝癌模型，不仅为肝癌研究提供新的更接近于临床肝癌生物学特性的实验材料，也是研究索拉非尼耐药机制和耐药逆转的有效模型。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞系领域，特别涉及对索拉非尼具有耐药性或敏感性的人肝癌细胞 系及其应用。
技术介绍
原发性肝癌具有发病例高、预后较差及病死率高等特点，是常见的恶性肿瘤的一 种。据最新的统计数据，肝癌全球新发例数约74. 8万，死亡病例69.6万，而其中半数发生在 中国。其发病例和死亡率在男性肿瘤患者中分别居于第5位，第2位；在女性肿瘤患者中分 别居于第 7 位和第6位（JemalA,&rayF,CenterMM,FerlayJ,WardE, D.Global cancerstatistics, 2011.CACancerJClin2011 ;61 (2) :69-90.陈建国，陈万青，张思维， 郑荣寿，朱健，张永辉.中国2003-2007年肝癌发病率与死亡率分析.中华流行病学杂志 2012 ；33(6) :547-53.) 〇 原发性肝癌起病隐匿，早期缺乏典型症状，早期诊断较困难，病程发展快，进展迅 速，确诊时大多数患者已经达到局部晚期或发生远处转移，治疗困难，预后很差，严重地威 胁人民群众的身体健康和生命安全。手术切除和肝移植是肝癌首选的治疗方法，但是大部 分患者化0-70%)确诊时时已经是晚期，失去手术治疗机会，只能采用其他治疗方案，包括 局部消融，肝动脉介入治疗（化疗和栓塞），放射治疗，系统性治疗（祀向药物索拉非尼，W 细胞毒药物阿霉素和奧沙利笛为主的联合治疗方案），中医药治疗W及免疫治疗等，其中化 学药物治疗起着重要作用。但是，传统的化疗方案（如阿霉素，笛类药物等）很难有效延长 晚期肝癌患者的生存期。 索拉非尼（sorafenib，商品名：多吉美，Nexavar)是一种多祀点抑制剂，它能抑制 Raf激酶的活性，阻断下游E服激酶的磯酸化，从而抑制肿瘤细胞的增值；同时它还祀向血 管内皮生长因子受体（Vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)和血小板 衍生生长因子受体（plateletderivedgrowthfactorreceptor,PDGFR),从而抑制肿瘤的 血管新生。索拉非尼能抑制肝癌细胞系的体外增殖，并能抑制送些细胞的体内肿瘤生长。在 两个大型III期临床实验中（SHARP和化iental)，索拉非尼的治疗都明显提高了患者的总生 存期和疾病进展时间。因此，2007年美国FDA和欧洲EAM相继批准其用于治疗晚期不能手 术的肝细胞肝癌，2008年中国SFDA批准其用于肝癌治疗，是目前临床用于晚期肝细胞肝癌 患者的标准化疗药物。 然而，索拉非尼的治疗效果比较短暂，只能延长患者数月的总生存期；大多数患者 在接受给药初期，表现良好效果；但是长期治疗后，肿瘤会出现耐药，并重新生长，疾病进 展，治疗失败。因此，建立对索拉非尼耐药的肝癌模型，并探索相关耐药机制，具有极其重大 的科研价值和临床意义。目前，对索拉非尼的耐药机制研究处于起步阶段，并且集中在体外 耐药细胞系模型上，对体内耐药的动物模型尚无明确报道。有研究团队用索拉非尼在细胞 水平长期作用于肝癌细胞系，诱导细胞耐药性发生，并和亲本细胞进行比较，寻找体外耐药 机制，发现耐药细胞出现Akt和STAT-3等信号通路的激活，W及EGFR/肥R-3受体的过度活 化，或者出现间质-上皮转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT)等，但是并没有 比较体外诱导耐药细胞在体内对索拉非尼的反应性。而在体内模型中，有研究团队将人肝 癌细胞系Hep3B接种到免疫缺陷小鼠体内，进行索拉非尼长期给药，诱导体内耐药产生；但 是他们发现送种耐药性是不稳定的而是可W产生逆转的。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对目前对索拉非尼耐药的临床前肝癌模型 匿乏，难W深入研究肝癌细胞对索拉非尼的耐药机制W及逆转药物开发送一技术难题，提 供了。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之一是；一种对索拉非尼具有耐药性 的人肝癌细胞系，其保藏在中国典型培养物保藏中必，保藏编号为CCTCCN0:C2013181。 本专利技术所述人肝癌细胞系较佳地还包括如上所述的人肝癌细胞系的子代细胞系。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之二是；如上所述的人肝癌细胞系在 制备使免疫缺陷哺乳动物产生肝癌的试剂中的用途。 本专利技术所述的在免疫缺陷哺乳动物中产生肝癌的试剂为本领域常规的试剂，该试 剂的制备方法较佳地为将本专利技术所述人肝癌细胞系混悬于各种溶剂中即得，所述溶剂为本 领域常规溶剂，较佳地为皿SS缓冲液，所述皿SS缓冲液的配方为：含500U/ml青霉素G、 500μg/ml硫酸链霉素和1. 25μg/ml两性霉素B。 本专利技术所述试剂较佳地用于制备肝癌动物模型。其中所述肝癌动物模型的制备方 法为本领域常规方法，较佳地包括W下步骤：将所述使免疫缺陷哺乳动物产生肝癌的试剂 接种于免疫缺陷缺陷动物，进行饲养，获得肝癌动物模型。其中所述免疫缺陷哺乳动物为本 领域常规的免疫缺陷哺乳动物，较佳地为免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷小鼠较佳地为裸小 鼠或严重联合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠），优选地为严重联合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠）， 其中所述裸小鼠较佳地为NU/NU品系的裸小鼠。 其中所述的接种的方式为本领域常规使用的接种方式。所述接种方式较佳地包括 皮下穿刺接种，原位接种或者肾囊膜内接种，优选地为皮下穿刺接种。所述接种的细胞量较 佳地为1. 0~2X1〇7个细胞，优选地为5. 0X1〇6个细胞。所得人肝癌动物模型对索拉非尼 的治疗具有耐药性，是索拉非尼治疗耐药性人肝癌动物模型。 本专利技术所述人肝癌动物模型的应用方法较佳地为，利用所得人肝癌动物模型检测 待测化合物的抑制肝癌活性，将待测化合物施用于人肝癌动物模型，观察和测量动物的体 重与肿瘤生长情况；施用后导致人肝癌动物模型肝癌症状改善或治愈的待测化合物具有抑 制肝癌活性。 其中所述的待测化合物施用的方法为本领域常规的施用方法，较佳地包括：尾静 脉注射、腹腔注射、灌胃、口服和肿瘤局部用药中的一种或几种方式施用于肝癌的荷瘤动 物。所述实验中的对照例较佳地为：同时使用不含待测化合物的溶剂施用于肝癌的荷瘤动 物作为对照。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之Η是；一种待测化合物抑制肝癌活 性的检测方法，该检测方法包括W下步骤：将待测化合物施用于细胞模型中，施用后抑制细 胞增殖或导致细胞调亡的待测化合物为具有抑制肝癌活性的待测化合物，其中所述的细胞 模型是如上所述的人肝癌细胞系。 本专利技术所述待测化合物抑制肝癌活性的检测方法为本领域常规的检测方法，所述 检测方法较佳地包括W下步骤： (1)将本专利技术所述人肝癌细胞系或其子代细胞接种于96孔细胞培养板孔中，培养 24小时； (2)将待测化合物稀释成不同浓度施用于细胞，化合物作用72小时后通过测定细 胞的活力，计算不同浓度的待测化合物对细胞的增殖抑制能力，计算待测化合物的半数抑 制浓度，用W判断待测化合物的抑制肝癌活性。 其中步骤（1)所述人肝癌细胞系或其子代细胞的接种量较佳地为5000/孔。其 中步骤（2)所述待测化合物的半数抑制浓度的检测方法较佳地包括ATP生物发光法或MTT 法，本专利技术所述检测方法优选地为ATP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对索拉非尼具有耐药性的人肝癌细胞系，其特征在于，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2013181。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡刚，张一心，刘继斌，方后顺，杨雪艳，汤旭蓁，谢付波，
申请(专利权)人：上海睿智化学研究有限公司，南通市肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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