一种筛选叶酸代谢相关药物的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选叶酸代谢相关药物的方法。所述方法包括如下步骤：(1)将生理状态稳定的细胞系分别与不同浓度的待测化合物混合，所述细胞系具有丝氨酸羟甲基转移酶表达功能；(2)加入稳定同位素标记的丝氨酸，孵育至反应充分；(3)取细胞培养液上清，检测所述稳定同位素标记的甘氨酸含量；(4)利用所述甘氨酸含量以及对应的待测化合物浓度判断待测化合物的活性。该检测方法筛选成功率高，筛到的化合物效用更强、副作用更小。

A Method for Screening Drugs Related to Folate Metabolism

The invention discloses a method for screening folic acid metabolism related drugs. The method comprises the following steps: (1) mixing physiological stable cell lines with different concentrations of compounds to be tested, which have the function of serine hydroxymethyltransferase expression; (2) adding stable isotope labeled serine to incubate until the reaction is adequate; (3) taking the supernatant of cell culture medium to detect the glycine content of the stable isotope labeled; (4) using the said stable isotope labeled serine. The content of glycine and the corresponding concentration of the compounds to be measured determine the activity of the compounds to be tested. The screening success rate of this method is high, and the compounds screened are more effective and less side effects.

【技术实现步骤摘要】
一种筛选叶酸代谢相关药物的方法
本专利技术属于生物检测领域，具体地涉及筛选叶酸代谢相关药物的方法。
技术介绍
二氢叶酸还原酶(DHFR，EC1.5.1.3)是生物体内利用NADPH还原二氢叶酸(dihydrofolate)产生四氢叶酸(tetrahydrofolate)的氧化还原酶。四氢叶酸及其衍生物是细胞内一碳单位的传递体，是必需的辅酶，参与DNA和氨基酸合成。DHFR是药物研发中的一个重要靶标，DHFR抑制剂研究长期以来都是抗癌药物研发的一个重要方向：肿瘤快速生长时，需要叶酸介导的一碳单位代谢为其提供充足的DNA及蛋白质合成原料；DHFR抑制剂通过特异性地与DHFR结合阻断其功能，使二氢叶酸不能转化为四氢叶酸，阻碍叶酸代谢，干扰DNA与蛋白质的合成，最终导致癌细胞死亡，从而达到治疗癌症的目的。DHFR一旦被抑制，将带来相应生物标志物合成速率的变化。业界现有的针对DHFR的药物筛选平台为酶学反应检测法，不能有效的评估药物在细胞中引发的生理反应。具有代表性的一种DHFR酶学反应检测法是由东京农业技术大学的Aiso等人于1999年开发(KenjiAiso,TomokoNozaki,MinoruShimoda,EiichiKokue,AssayofDihydrofolateReductaseActivitybyMonitoringTetrahydrofolateUsingHigh-PerformanceLiquidChromatographywithElectrochemicalDetection,AnalyticalBiochemistry,Volume272,Issue2,1999,Pages143-148,ISSN0003-2697)。以此方法为例：首先，由这方法筛选出的化合物，很多都没有较好的细胞通透性，难以进入细胞发挥作用；其次，这种方法无法检测化合物的副作用或毒性；最后，某些本身活性不强的化合物在进入细胞后，经过代谢可能变成强活性的化合物—此方法无法检测出这些化合物。因此，这种方法筛选出的化合物很多都无法实际应用于下游的动物体内实验或临床实验。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为了克服现有技术中使用酶学反应检测法筛选针对DHFR的药物具有不能有效评估药物在细胞中引发的生理反应、筛选得到的化合物无法应用于下游的体内实验或者临床实验等缺陷，提供一种筛选叶酸代谢相关药物的方法。该方法可以有效评估药物在细胞内引发的生理反应，且该方法筛选成功率高，筛到的化合物效用更强、副作用更小。甘氨酸与丝氨酸在细胞内的生成依赖于叶酸代谢相关的一碳单位途径：SHMT(丝氨酸羟甲基转移酶)催化丝氨酸和四氢叶酸转化为甘氨酸和亚甲基四氢叶酸，这一可逆反应中四氢叶酸是一碳单位的接受体。一旦DHFR受到抑制，细胞内缺乏四氢叶酸，丝氨酸转化为甘氨酸这一生理过程就无法完成。本专利技术创造性地将该叶酸代谢相关途径与生物标志物检测法相结合，建立一种新的、基于检测细胞内生物标志物合成速率来测评生物活性的检测法：检测所得生物标志物——甘氨酸的生成速率可以反映药物作用于DHFR的效果。本专利技术解决上述技术问题的技术方案之一为：一种筛选叶酸代谢相关药物的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将生理状态稳定的细胞系分别与不同浓度的待测化合物混合或接触，所述细胞系具有丝氨酸羟甲基转移酶表达功能；优选HCT-116、MV-4-11、HL-60或者HEK293；(2)加入稳定同位素标记的丝氨酸至所述细胞系，孵育至反应充分；(3)取细胞培养液上清，检测所述稳定同位素标记的甘氨酸含量；(4)利用所述甘氨酸含量以及对应的待测化合物浓度判断待测化合物的活性。其中，步骤(1)中使用具有丝氨酸羟甲基转移酶表达功能的细胞系，使得这些细胞对有效化合物更敏感，有助于得到较强的检测信号，提高实验灵敏度。本专利技术中，步骤(1)中所述生理状态稳定的细胞系为培养16～48小时，优选18～24小时后贴壁生长的细胞；较佳地，所述细胞培养的培养液为McCoy's5aMediumModified+10％FBS。本专利技术中，步骤(1)所述浓度从1E-5M开始，2倍稀释8个浓度。本专利技术中，为更好地反映检测的结果，步骤(1)中还包括阳性对照，所述阳性对照较佳地为DHFR的抑制剂，更佳地为Pemetrexed。本专利技术中，步骤(2)中所述反应充分指的是大部分稳定同位素标记的丝氨酸和四氢叶酸在细胞内转化为甘氨酸和亚甲基四氢叶酸；较佳地，所述孵育的时间为3.5～4.5小时，更佳地为4小时。本专利技术中，步骤(2)所述稳定同位素为本领域常规的尚未发现其可自行衰变的同位素，例如8O、2H或者13C等常规的稳定同位素，以下列举几种标记方式：；优选2H。本专利技术中，步骤(2)所述稳定同位素标记的丝氨酸的终浓度为15～25μM，优选20μM。所述稳定同位素标记的丝氨酸的终浓度的设定兼顾了增强检测信号、提高实验灵敏度，且避免过度原料消耗以及实验信号背景过大。本专利技术中，所述步骤(2)与步骤(1)的时间间隔小于30s。本专利技术中，步骤(3)所述检测为LC-MS检测。本专利技术中，步骤(4)所述判断化合物活性为计算待测化合物的IC50值。本专利技术解决上述技术问题的技术方案之二为：一种测评叶酸代谢相关的药物活性的方法，其包括上述筛选叶酸代谢相关药物的方法。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术建立的检测方法通过研究细胞对化合物的生理反应来评测化合物，该方法能够评估化合物进入细胞的通透性、化合物对细胞的毒性或副作用，并能够测得化合物进入细胞经过代谢后活性强弱的转换；该检测方法筛选成功率高，筛到的化合物效用更强、副作用更小。附图说明图1为现有酶学反应检测法与本专利技术生物标志物检测法结果比较。图2为酶学方法和本专利技术方法所得数据的线性拟合图。图3为比较不同浓度的稳定同位素标记的丝氨酸对本实验影响的结果：图3a为10μM对比20μM；图3b为20μM对比30μM；横坐标为待测化合物的浓度，纵坐标为稳定同位素标记的甘氨酸的含量。图4为使用HEK293细胞和SHMT1基因敲除细胞的结果比较；横、纵坐标的指代同图3。图5a～5c为分别使用MV-4-11、HL-60和HEK293的实验结果；横、纵坐标的指代同图3。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。HCT-116细胞株：购自ATCC(货号CCL-247)；McCoy's5aMediumModified细胞培养基：购自ATCC(货号30-2007)；96孔细胞培养板：购自Corning(货号CLS3595)；稳定同位素(2H)标记丝氨酸：购自CambridgeIsotopeLab(货号：CDNLM-6813-PK)。实施例1检测方法构建(1)将HCT-116细胞以80,000细胞/孔，100μL/孔的方式铺板于96孔细胞培养板。于37℃，5％CO2培养箱内过夜孵育。(2)使用细胞培养液(McCoy's5aMediumModified+10％FBS)为稀释液，将待测化合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选叶酸代谢相关药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将生理状态稳定的细胞系分别与不同浓度的待测化合物混合或接触，所述细胞系具有丝氨酸羟甲基转移酶表达功能；优选HCT‑116、MV‑4‑11、HL‑60或者HEK293；(2)加入稳定同位素标记的丝氨酸至所述细胞系，孵育至反应充分；(3)取细胞培养液上清，检测所述稳定同位素标记的甘氨酸含量；(4)利用所述甘氨酸含量以及对应的待测化合物浓度判断待测化合物的活性。

【技术特征摘要】
2017.07.07 CN 20171055212781.一种筛选叶酸代谢相关药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将生理状态稳定的细胞系分别与不同浓度的待测化合物混合或接触，所述细胞系具有丝氨酸羟甲基转移酶表达功能；优选HCT-116、MV-4-11、HL-60或者HEK293；(2)加入稳定同位素标记的丝氨酸至所述细胞系，孵育至反应充分；(3)取细胞培养液上清，检测所述稳定同位素标记的甘氨酸含量；(4)利用所述甘氨酸含量以及对应的待测化合物浓度判断待测化合物的活性。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述生理状态稳定的细胞系为培养16～48小时，优选18～24小时后贴壁生长的细胞，较佳地所述细胞培养的培养液为McCoy's5aMediumModified+10％FBS。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏照阳，孟俊伟，
申请(专利权)人：上海睿智化学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31