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天然纳米囊泡外秘体用于制备调控细胞对索拉非尼敏感性以及c‑Met信号通路制剂制造技术

技术编号:14752990 阅读:138 留言:0更新日期:2017-03-02 09:57
本发明专利技术涉及生物医药和分子靶向治疗领域。本发明专利技术公开并提供了一种来源于肿瘤细胞的天然脂质纳米囊泡结构即外秘体的制备方法,及其在制备调控肝细胞癌对索拉非尼敏感性以及c‑Met信号通路制剂中的应用。本发明专利技术通过差速离心的方法提取获得肿瘤细胞的外泌体,这些外泌体可以在体内和体外明显诱导肝癌细胞对索拉菲尼的抵抗。因此,本发明专利技术获得的外泌体具有以下应用:1、在体外细胞上诱导发生对索拉非尼的敏感性降低;2、在体内动物荷瘤模型上诱导发生对索拉非尼的敏感性降低;3、在体内外将该外秘体用于保护细胞免受药物引起的细胞凋亡;4、在体内外将该外秘体用于激活细胞的HGF/c‑Met/Akt信号通路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药和分子靶向治疗领域,具体涉及天然纳米囊泡外秘体、制备方法及其用途。
技术介绍
外泌体(exosome)作为物质运输载体在细胞内和细胞间的信息交流中发挥重要作用,它们可以传递多种生物分子调控细胞微环境,包括mRNA,miRNA及蛋白等。既往研究发现,肿瘤来源的外泌体在上皮间质转化(EMT)、肿瘤血管生成、肿瘤转移等方面发挥调控作用。本专利技术,我们发现来源于肿瘤细胞的外泌体可在体内和体外降低细胞对索拉菲尼的敏感性,肿瘤来源外泌体可通过保护索拉菲尼引起的细胞凋亡以及促进细胞激活HGF/c-Met/Akt信号通路激发药物敏感性的降低抵抗。因此,本专利技术获得的外泌体具有以下应用:1、在体外细胞上诱导发生对索拉非尼的敏感性降低;2、在体内动物荷瘤模型上诱导发生对索拉非尼的敏感性降低;3、在体内外将该外秘体用于保护细胞免受药物引起的细胞凋亡;4、在体内外将该外秘体用于激活细胞的HGF/c-Met/Akt信号通路。
技术实现思路
本专利技术公开并提供了一种来源于肿瘤细胞的天然脂质纳米囊泡结构即外秘体的制备方法,及其在制备调控肝细胞癌对索拉非尼敏感性以及c-Met信号通路制剂中的应用。本专利技术通过差速离心的方法提取获得肿瘤细胞的外泌体,这些外泌体可以在体内和体外明显诱导肝癌细胞对索拉菲尼的抵抗,且高侵袭肿瘤细胞来源的外泌体作用更强。肿瘤来源的外泌体可通过保护化疗药物引起的细胞凋亡以及促进肿瘤细胞激活HGF/c-Met/Akt信号通路,诱导药物抵抗。因此,本专利技术获得的外泌体具有以下应用:1、在体外细胞上诱导发生对索拉非尼的敏感性降低;2、在体内动物荷瘤模型上诱导发生对索拉非尼的敏感性降低;3、在体内外将该外秘体用于保护细胞免受药物引起的细胞凋亡;4、在体内外将该外秘体用于激活细胞的HGF/c-Met/Akt信号通路。以下通过实施例对本专利技术作进一步详细的说明,但本专利技术的保护范围不受具体实施例的任何限制,而是由权利要求加以限定。附图说明图1不同细胞系来源的外泌体的特征图2荧光显微镜检测示MHCC-97H来源的外泌体被肝癌细胞内化、吸收图3肝癌细胞来源的外泌体诱导肝癌索拉非尼抵抗,索拉菲尼联合肝癌细胞来源的外泌体组裸鼠皮下肿瘤体积明显大于单独应用索拉菲尼组,且高侵袭肝癌细胞来源的外泌体促索拉菲尼抵抗效果强于低侵袭来源的外泌体组图4肝癌来源的外泌体体外诱导SMMC-7721细胞索拉菲尼抵抗图5肝癌细胞来源的外泌体体外逆转索拉菲尼引起的肝癌细胞凋亡图6TUNEL法检测肝癌来源的外泌体体内对索拉菲尼引起的肝癌细胞凋亡的影响图7肝癌细胞来源的外泌体降低索拉菲尼引起的凋亡相关蛋白caspase和PARP水平图8肝癌细胞来源的外泌体通过HGF/c-Met/Akt信号通路影响索拉菲尼抵抗具体实施方式实施例外秘体的制备及对索拉非尼敏感性调控的体内外效应研究1材料和方法1.1细胞系和细胞培养人肝癌细胞系SMMC-7721来自上海生科院细胞库,MHCC-97H,MHCC-97L和LO2来自复旦大学肝癌研究所。MHCC-97H,MHCC-97L用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,LO2用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。所有细胞系培养在37℃、含5%二氧化碳的培养箱中。1.2外泌体抽提MHCC-97L,MHCC-97H和LO2细胞培养在含10%胎牛血清(超速离心过夜去除外泌体)的相应培养基中。48小时后,收集细胞培养基,按先前文献描述的通过差速离心的方法提取相应的外泌体[TheryC,AmigorenaS,RaposoG,ClaytonA:Isolationandcharacterizationofexosomesfromcellculturesupernatantsandbiologicalfluids.CurrProtocCellBiol2006,Chapter3:3-22.]。最后,采用BCA蛋白浓度测定外泌体内的蛋白含量;Westernblotting方法检测外泌体标志蛋白CD9和CD63。提取的外泌体存放于80℃备用。1.3动物模型所有的实验程序都遵循中国实验动物相关法规。25只雄性裸鼠(4-6周龄)购于海实验动物中心。所有裸鼠经利多卡因局部浸润麻醉后(0.25%)在右腋窝皮下注射SMMC-7721细胞(1×107细胞/200μLPBS每只)。当肿瘤达到体积50-100mm3时,将鼠随即分为5组(n=5,分别为对照组,索拉菲尼组,索拉菲尼+LO2外泌体组,索拉菲尼+MHCC97L外泌体组,索拉菲尼+MHCC97H外泌体组)。索拉非尼(100mg/kg,Selleck,USA)经裸鼠腹腔注射,同时裸鼠瘤体皮下注射不同来源的外泌体(100μg总蛋白/100μLPBS)。皮下注射等体积PBS作为对照。每2天检查裸鼠肿瘤体积。皮下注射处理二十五天后,所有小鼠经水合氯醛(5%,100μL/10g)麻醉后颈椎脱臼法处死。1.4细胞活力分析用MTT法检测细胞存活率。简言之,5×103接种在96孔板上。经索拉菲尼单独或联合不同来源外泌体共同孵育24或48小时,20μLMTT溶液(0.5%)添加到培养基中,培养4h后,培养基中取出,150μLDMSO添加到每孔并摇床震荡10min。最后用分光光度计测定490nm的有色溶液的吸光度。所有的实验重复三遍。1.5Westernblot分析肝癌细胞经含1%蛋白酶抑制剂(Thermo,USA)的RIPA裂解缓冲液(碧云天,中国)裂解,等量的蛋白质经10%SDS-PAGE电泳。CD9、CD63、GAPDH、caspase-9,caspase-3,PARP,c-Met,p-met,AKT,P-AKT、VEGFR2和p-VEGFR2等抗体来自美国CST公司。MET抑制剂crizotinib(PF-02341066)和磷酸化Akt抑制剂MK-22062hcl购自中国Selleck化学公司。一抗孵育后经与辣根过氧化物酶标记的二次抗体孵育4h。蛋白条带采用增强化学发光(Millipore,USA)显示。1.6荧光显微镜分析MHCC-97H来源的外泌体经CM-DIL(Sigma,USA)标记,方法如下,100μgMHCC-97H来源的外泌体经1mlPBS稀释,2μlCM-DIL与1ml外泌体悬液室温孵育15min。然后加入18mLPBS,4℃下120000g离心2小时,除去上清,沉淀经20mLPBS重悬,再次4℃下120000g离心2小时。含CM-Dil标记的外泌体沉淀经200μlPBS重悬。SMMC-7721-GFP细胞培养于细胞爬片上至汇合度约80%。在培养基中加入含CM-Dil标记的外泌体溶液,在37℃含5%CO2的细胞培养箱中孵育4小时。培养后的细胞,PBS洗两次,然后经4%多聚甲醛固定10分钟。爬片经抗淬灭剂处理,利用荧光显微镜观察分析。1.7TUNEL分析裸鼠皮下肿瘤标本经常规方法石蜡包埋、切片。凋亡细胞采用TUNEL法检测。操作步骤按照原位细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物,中国)指示。简言之,20mg/mL的蛋白酶K试剂在室温下与细胞孵育30min,经平衡溶液孵育10秒钟。细胞用PBS洗一遍后,37℃下经100ulStreptacidin-FITC处理1本文档来自技高网...
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【技术保护点】
一种天然来源的纳米囊泡即外秘体在制备下调细胞对索拉非尼敏感性制剂上的应用。

【技术特征摘要】
1.一种天然来源的纳米囊泡即外秘体在制备下调细胞对索拉非尼敏感性制剂上的应用。2.如权利要求1所述的一种天然来源的纳米囊泡即外秘体在制备下调细胞对索拉非尼敏感性制剂上的应用,其特征为所述细胞为体外培养的细胞或者体内移植荷载的细胞。3.如权利要求1或者2所述的一种天然来源的纳米囊泡即外秘体在制备下调细胞对索拉非尼敏感性制剂上的应用,其特征为所述天然来源的纳米囊泡即外秘体通过保护细胞免受药物引起的细胞凋亡达到下调细胞对索拉非尼的敏感性。4.如权利要求1或者2所述的一种天然来源的纳米囊泡即外秘体在制备下调细胞对索拉非尼敏感性制剂上的应用,其特征为所述天然来源的纳米囊泡即外秘体通过激活细胞的HGF/c-M...

【专利技术属性】
技术研发人员:丁义涛屈振江春平吴俊艺吴俊华
申请(专利权)人:南京大学
类型:发明
国别省市:江苏;32

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