一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其中，所述方法包括构建含多个神经营养因子的融合基因片段，重组到病毒表达载体上，转染人干细胞，可高表达含多个神经营养因子的融合蛋白，发挥其共同作用促进神经功能的修复；同时也利用了干细胞自身增殖分化能力，参与神经功能的修复，无成瘤性；本发明专利技术提供的人干细胞将有望对神经系统疾病的达到更佳的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种神经修复功能提高的人干细胞的方法以及通过所述方法获得促进神经修复的人干细胞，特别地，本专利技术涉及构建含多个神经营养因子融合基因的重组病毒载体，使得人干细胞能稳定表达多个神经营养因子的融合蛋白，共同发挥神经营养因子生物学功能；本专利技术的神经修复功能提高的人干细胞保持良好的增殖能力，促进神经修复的提高，而无成瘤性，可望用于临床治疗神经系统疾病，促使受损神经细胞的修复。
技术介绍
目前成体干细胞已经用于临床治疗神经系统疾病，包括神经干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞等，在临床上取得了很好的疗效。多数人干细胞来源于废弃的流产胚胎和脐带，在体外培养获得足够多的干细胞数，然后通过静脉、动脉介入或立体定像进行移植治疗。另外成体干细胞来源可以自体，因而不存在胚胎干细胞移植所存在的免疫排斥、伦理学及致瘤性等方面的限制，具有良好的临床应用前景。但是成体干细胞移植治疗让人困惑的是成体干细胞移植后进入病灶位发挥修复功能的干细胞数量是有限的，部分干细胞在迁移到病灶位之前可能已经死亡或凋亡了，最后发挥神经修复功能的干细胞就更为有限了，这严重限制了成体干细胞自体移植的临床效果。而成体干细胞分泌的神经营养因子在神经修复中发挥了一定的作用，其可以改善颅内微环境，促进干细胞和内源性的神经干细胞修复作用，但是干细胞分泌的神经营养因子也是有限的，有研究认为实际上干细胞移植治疗，真正发挥作用的是其分泌的神经营养因子。本专利技术将构建好的含多个神经营养因子的融合基因片段，重组到病毒载体上，感染人干细胞后表达含多个神经营养因子的融合蛋白，共同发挥这些神经营养因子的生物学功能，而无成瘤性。人干细胞来源方便，主要包括人神经干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、脂肪干细胞、视网膜祖细胞和胚胎干细胞等，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以作为异体规模化生产。因而，本专利技术表达含多个神经营养因子融合蛋白的人干细胞制备简单，可表达多个神经营养因子融合蛋白，共同创造有利于神经再生的微环境，有望对神经系统疾病产生更好的治疗效果，能个体化临床治疗，也能作为规模化生产的产品应用于临床治疗神经系统疾病。
技术实现思路
许多临床研究已发现干细胞在治疗神经系统疾病中发挥着独特的功能，能促进缺血区的新血管再生及神经再生，修复受损的组织，主要是通过分泌神经营养因子和细胞因子的作用，改善机体微环境，调动机体内源性干细胞参与神经修复功能。然而临床使用人干细胞表达的神经营养因子和细胞因子是非常有限的。本专利技术利用人干细胞分化再生和“归巢”的特性，将构建的含多个神经营养因子的融合基因片段的重组病毒载体进行转染，可表达含多个神经营养因子的融合蛋白，共同发挥神经营养因子的生物学作用和干细胞本身的功能，改善颅内微环境，促进内源性神经干细胞增殖分化，参与神经修复。其中，所述神经营养因子至少包括脑源性神经营养因子、神经生长因子和神经营养因子3；按照荧光定量PCR试剂盒的使用说明书进行检测，转染了BDNF-L-NT3-L-GDNF病毒载体的hNSCs传代培养到第10代后，其表达BDNF-L-NT3-L-GDNF基因比未转染的hNSCs高至少45倍；所述人干细胞过表达神经营养因子，细胞免疫荧光检测神经干细胞标志物巢蛋白和DAPI表达90％以上。神经营养因子(neurotrophin，NT)包括脑源性神经营养因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子等，它们在促使神经元存活、生长、分化和维持其功能方面发挥着关键的作用。脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactors，BDNF)对周围神经元和中枢神经元具有广谱的营养保护作用；神经营养因子3(neurotrophin-3，NT-3)参与调控脊髓发育，影响神经-肌肉突触功能活性；胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF)对保护多巴胺运动神经元、中枢及外周的运动神经元、感觉神经元及交感神经元等都具有同等的营养作用。需要应用这些神经营养因子靶向神经干细胞存活、生长、分化和维持其功能，将有助于减少患者神经细胞病变和促进神经组织再生。本专利技术经我们研发工作发现了神经营养因子慢病毒载体转染的人干细胞，其稳定表达的神经营养因子能提高神经修复能力，而且无成瘤活性。这一研究结果提示了我们可以通过多个神经营养因子的融合基因构建慢病毒载体转染人干细胞，使得人干细胞经多次传代培养后仍稳定表达含多个神经营养因子的融合蛋白，具有发挥其各自生物学功能的能力。在保证了临床治疗使用的细胞数量的同时，也保持了干细胞很强的增殖、分化、归巢活性，可能在临床治疗神经系统疾病中发挥着更好的作用。本专利技术提供了一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建含多个神经营养因子的融合基因片段，重组到病毒表达载体上并转染人干细胞，制备成可高表达含多个神经营养因子融合蛋白的干细胞，促进神经损伤修复，提高人干细胞发挥更佳的神经功能修复。本专利技术所述的含多个神经营养因子的融合基因片段是通过PCR技术扩增含多个神经营养因子cDNA序列，重组到表达质粒上，经酶切位点连接到病毒表达载体上，基因重组病毒载体转染人干细胞，获得促进神经修复的人干细胞。所述促进神经修复的神经营养因子cDNA序列之间通过一个无关DNA序列(Linker)链接，构建成融合基因片段，然后重组到病毒表达载体上。本专利技术所述的促进神经修复的神经营养因子，包括脑源性神经营养因子，神经生长因子、神经营养因子3、神经营养因子4和胶质细胞源性神经营养因子中的三种以上。本专利技术所述人干细胞包括神经干细胞(neuralstemcell，NSC)、间充质干细胞、内皮祖细胞、脂肪干细胞、视网膜祖细胞和胚胎干细胞等，优选地，为神经干细胞。由于人干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人神经干细胞来源人废弃脐带血、胎盘血或自体骨髓等，优选地，来源于人自体骨髓和脐带。本专利技术所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。本专利技术提供一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其特征在于，将人BDNF、NT3和GDNF序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，在人BDNFcDNA设计反链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的引物，NT3设计在正链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3和反链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的一对引物，GDNF设计在正链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3的引物，通过PCR方法将三者扩增连接在一起，形成完整的含人BDNF、NT3和GDNF的DNA，两者之间由表达连接DNA链接，即BDNF-L-NT3-L-GDNF(bng)。将BDNF-L-NT3-L-GDNF的目的DNA片段连接到表达质粒上构建成重组质粒后，经阳性克本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建含多个神经营养因子的融合基因片段，重组到病毒表达载体上并转染人干细胞，制备成可高表达含多个神经营养因子融合蛋白的干细胞，促进神经损伤修复，提高人干细胞发挥更佳的神经功能修复；其中，所述神经营养因子至少包括脑源性神经营养因子、神经生长因子和神经营养因子3；按照荧光定量PCR试剂盒的使用说明书进行检测，转染了BDNF‑L‑NT3‑L‑GDNF病毒载体的hNSCs传代培养到第10代后，其表达BDNF‑L‑NT3‑L‑GDNF基因比未转染的hNSCs高至少45倍；所述人干细胞过表达神经营养因子，细胞免疫荧光检测神经干细胞标志物巢蛋白和DAPI表达90％以上。

【技术特征摘要】
1.一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其特征在于，所述方
法包括构建含多个神经营养因子的融合基因片段，重组到病毒表达载体上并转
染人干细胞，制备成可高表达含多个神经营养因子融合蛋白的干细胞，促进神
经损伤修复，提高人干细胞发挥更佳的神经功能修复；其中，所述神经营养因
子至少包括脑源性神经营养因子、神经生长因子和神经营养因子3；
按照荧光定量PCR试剂盒的使用说明书进行检测，转染了
BDNF-L-NT3-L-GDNF病毒载体的hNSCs传代培养到第10代后，其表达
BDNF-L-NT3-L-GDNF基因比未转染的hNSCs高至少45倍；
所述人干细胞过表达神经营养因子，细胞免疫荧光检测神经干细胞标志物
巢蛋白和DAPI表达90％以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过PCR技术扩增含多个
神经营养因子cDNA序列，重组到表达质粒上，经酶切位点连接到病毒表达载
体上，基因重组病毒载体转染人干细胞，获得促进神经修复的人干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法其特征在于所述神经营养因子cDNA
序列之间通过一个无关DNA序列(Linker)链接，不影响神经营养因子的生
物学功能，构建成融合基因片段，然后重组到病毒表达载体上。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于所述神经营养因子，
包括脑源性神经营养因子，神经生长因子、神经营养因子3、神经营养因子4
和胶质细胞源性神经营养因子中的三种以上；
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述人干细胞为
神经干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、脂肪干细胞、视网膜祖细胞或胚胎
干细胞，优选地，为神经干细胞。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述人干细胞来源
人废弃流产胚胎、废弃脐带、脐血或自体骨髓经体外培养获得的，优选地，来
源于人自体骨髓或脐带。
7.一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其特征在于，
将人BDNF、NT3和GDNF序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩

\t增下来，在人BDNFcDNA设计反链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)
3的引物，NT3设计在正链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3和反
链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的一对引物，GDNF设计在正
链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3的引物，通过PCR方法将三者
扩增连接在一起，形成完整的含人BDNF、NT3和GDNF的DNA，两者之间由
表达连接DNA链接，即BDNF-L-NT3-L-GDNF；
将BDNF-L-NT3-L-GDNF的目的DNA片段和pUC229载体HindIII/BamHI
双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于4℃、12小时连接反应制备克隆
连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；
PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合BDNF-L-NT3-L-GDNF大小和序列后，
将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过
夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的
重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存；所述BDNF-L-NT3-L-GDNF大小
为2487bp；
将BDNF-L-NT3-L-GDNF的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体Hind
III/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37℃、12小时连接反
应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定
和测序鉴定；

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建勋，
申请(专利权)人：紫程瑞生会北京生物技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11