一种免疫细胞来源的生物美容原料的制备方法及其产品技术

本发明专利技术提供了一种免疫细胞来源的生物美容原料的制备方法，其中，所述方法包括通过从培养免疫细胞的培养液和裂解免疫细胞获得的蛋白悬液，经超浓缩后制备成免疫细胞精华液，富含抗炎抗氧化成分，具有抗炎抗氧化的功效；进一步冷冻干燥后制备成冻干粉，可以长期在‑80℃超低温冰箱保存，成为皮肤抗炎抗氧化的生物美容原料；添加到面霜、润肤露和爽肤水中可以制备成抗炎抗氧化面霜产品，加入到面膜中可以制备成抗炎抗氧化面膜产品以及直接制备成抗炎抗氧化精华液产品，可用于皮肤粉刺、除斑、防晒和抗氧化等美容。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备免疫细胞来源的生物美容原料的方法以及通过所述方法获得的免疫细胞来源的生物美容产品。特别地，本专利技术涉及采用从培养免疫细胞的培养液和裂解免疫细胞获得的蛋白悬液，经超浓缩后制备成免疫细胞精华液，冷冻干燥后制备成冻干粉的生物美容原料，富含抗炎抗氧化成分，具有抗炎抗氧化的功效，可以制备成面霜、润肤露、爽肤水、面膜和精华液等产品，可用于皮肤粉刺、除斑、防晒和抗氧化等美容。
技术介绍
目前，各种化妆品主要以化学成分为主，再添加了一些植物提取精华素或者其他深海营养物质制备成的美容产品，对皮肤发挥保湿、美白和控油等作用。尽管这些化妆品含有一些营养物质，但因其有效成分含量和有效性等问题，在皮肤抗炎抗氧化等方面还远远不足。近年来，由于生物技术的发展，采用基因工程技术获得细胞因子基因重组载体，在大肠杆菌或酵母中发酵，大量获得相关细胞因子。作为营养因子添加到化妆品中或直接使用，在皮肤修复、抗炎和抗氧化中起到一定效果。但由于这些细胞因子是在大肠杆菌或酵母等低等细胞中表达的，其缺少在哺乳动物细胞中的蛋白转录翻译后修饰，包括糖基化、甲基化和末端修饰等过程，其功能和生物活性受到很大限制。所以使用大肠杆菌或酵母中发酵制备的细胞因子应用在化妆品中，很多可能生物活性不高甚至无效，或者由于免疫原性问题皮肤造成过敏现象。本专利技术采用人免疫细胞在细胞因子作用下连续培养，这些免疫细胞可天然地表达和分泌大量的细胞因子，人免疫细胞表达和分泌的蛋白具有良好的转录翻译后修饰，具有很好生物活性。这样一来，也避免了进行基因重组构建，免疫细胞能表达和分泌大量天然的细胞因子，没有任何基因修饰而造成异源性免
疫原性高的问题，这些细胞因子富含抗免疫炎症和抗氧化相关的分子。综上所述，本专利技术利用人免疫细胞表达和分泌的细胞因子，通过裂解、浓缩和冷冻干燥后制备成成品，在生物学有效期内更好储存及时使用，将对青春痘、粉刺和皮疹等皮肤产生最佳的抗炎和抗氧化等美容作用。
技术实现思路
经过本专利技术科研人员长期免疫细胞培养与美容应用的研究，为了对皮肤的青春痘、粉刺和皮疹等产生更好地抗炎和抗氧化等的作用，发现人免疫细胞表达和分泌的细胞因子产生很好的消炎去肿、去红斑和修复等作用，而且联合美容物理疗法将产生更好功效。本专利技术通过从培养免疫细胞的培养液和裂解免疫细胞获得的蛋白悬液，经超浓缩后制备成免疫细胞精华液，富含抗炎抗氧化成分，具有抗炎抗氧化的功效。这些抗炎症分子主要包括白介素12(interleukin 12，IL-12)、白介素8(interleukin 8，IL-8)、白细胞介素-1受体拮抗剂(interleukin1 receptor antagonist，IL-1Ra)、干扰素α(interferon α，TFN-α)和干扰素γ(interferonγ，TFN-γ)等；抗氧化分子主要包括转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)和超氧化歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)等；免疫细胞裂解液还含有核因子相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)，具有抗炎症和抗氧化双重功能；生长分子：细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、和中性粒细胞胞浆因子2(NCF-2)。免疫细胞分泌的抗炎症分子能够特异性地抑制炎症，截断炎症产生的途径，弱化炎症反应；维持真皮层细胞正常生理环境，抑制受损细胞与表皮细胞的粘附，防止炎症在细胞间的扩散，促进受损细胞代谢自然剥落，恢复皮肤健康；同时能够抑制皮肤组织产生可激发炎症的毒素成分；对免疫复合物所诱导的炎症反应同样具有缓解功效。免疫细胞分泌的抗氧化分子可清除机体代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基，提高皮肤对自由基损伤而诱发疾病和对自由基外界诱发因子的抵抗力。Nrf2是结合抗氧化反应元件的基本转录因子，诱导抗氧化反应元件的目标基因表达，其中包括谷胱甘肽(glutathione，r-glutamyl cysteingl+glycine，
GSH)，能诱导多种类型的GST基因表达，而GST是具有抗氧化和整合解毒作用之王。而Nrf2高表达能抑制炎症相关因子如(IL)-1β、IL-6，TNF-α、iNOS和COX2等的表达，因而Nrf2不仅是抗氧化系统的总司令，在抗炎症方面也发挥关键作用。同时我们发现ICAM-1和NCF-2具有更好地促进皮肤成纤维细胞增殖和分化，表达胶原蛋白和弹性蛋白，改善皮肤肤质，特别是对皮肤瘢痕和疤痕具有很好修复作用。本专利技术提供了一种培养免疫细胞来源的生物美容原料的制备方法，其中，所述方法包括通过从培养免疫细胞的培养液和裂解免疫细胞获得的蛋白悬液，经超浓缩后制备成免疫细胞精华液，富含抗炎抗氧化成分；经冷冻干燥后制备成冻干粉，可以长期在-80℃超低温冰箱保存，成为皮肤抗炎抗氧化的生物美容原料。本专利技术提供的人免疫细胞为细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞等，优选地，为细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤T淋巴细胞。所述免疫细胞来源人外周血或脐带血，经淋巴细胞分离液密度梯度离心后获得单个核细胞，使用细胞因子干扰素γ、抗人CD3单抗、白介素1α和白介素2在无血清培养基中连续培养20天获得细胞因子诱导杀伤细胞及其培养液；或通过细胞因子白介素15、白介素18和白介素2在无血清培养基中连续培养20天获得自然杀伤细胞及其培养液；或通过细胞因子白介素15和α-GalCer在无血清培养基中连续培养20天获得自然杀伤T淋巴细胞及其培养液。优选地，所述的MSC无血清培养基含0.1-200μg/ml氢化可地松、1-500μg/ml抗坏血酸和1-1000μg/ml人胰岛素，我们发现可以促进细胞生长因子的分泌和表达，提高细胞生长因子的含量，特别是促使了ICAM-1和NCF-2的表达。培养获得免疫细胞经超声破碎后高速低温离心，获得细胞裂解上清，与免疫细胞培养液混匀后浓缩，然后在冷冻干燥仪中冷冻干燥得到冻干粉，压盖密封后贴签，放置-80℃冰箱保存。本专利技术制备的免疫细胞培养液、含免疫细胞裂解液的培养液及其浓缩液经
酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含抗炎抗氧化分子，即：培养免疫细胞的培养液中分泌的抗炎症分子白介素12含量超过10000pg/ml，白介素8含量超过100000pg/ml和白细胞介素-1受体拮抗剂含量超过5000pg/ml；抗氧化因子转化生长因子β1含量超过7000pg/ml和超氧化歧化酶含量超过2000pg/ml，以及细胞间粘附分子-1含量超过1500pg/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过4000pg/ml。含免疫细胞裂解液的培养液中抗炎症分子白介素12含量超过20ng/ml，白介素8含量超过150ng/ml和白细胞介素-1受体拮抗剂含量超过15ng/ml；抗氧化因子转化生长因子β1含量超过13ng/ml和超氧化歧化酶含量超过5ng/ml；抗炎症和抗氧化双重作用分子核因子相关因子2含量超过5ng/ml；以及细胞间粘附分子-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫细胞来源的生物美容原料的制备方法，其特征在于，所述方法包括通过从培养人免疫细胞的培养液和裂解人免疫细胞获得的蛋白悬液，经超浓缩后制备成免疫细胞精华液；经冷冻干燥后制备成冻干粉，可以长期在‑80℃超低温冰箱保存；其中，免疫细胞的培养使用无血清培养基，优选其含0.1‑200μg/ml氢化可地松、1‑500μg/ml抗坏血酸和1‑1000μg/ml人胰岛素。所述免疫细胞精华液或冻干粉可用作生物美容原料；所述免疫细胞培养液、含免疫细胞裂解液的培养液及其浓缩液富含白介素12(interleukin 12，IL‑12)、白介素8(interleukin 8，IL‑8)、白细胞介素‑1受体拮抗剂(interleukin 1 receptor antagonist，IL‑1Ra)、转化生长因子β1(transforming growth factor‑β1，TGF‑β1)、超氧化歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、核因子相关因子2(nuclear factor E2‑related factor 2，Nrf2)、细胞间粘附分子‑1(ICAM‑1)、中性粒细胞胞浆因子2(NCF‑2)；培养人免疫细胞的培养液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测，其中，抗炎症分子白介素12含量超过10000pg/ml，白介素8含量超过100000pg/ml和白细胞介素‑1受体拮抗剂含量超过5000pg/ml；抗氧化因子转化生长因子含量超过7000pg/ml和超氧化歧化酶含量超过2000pg/ml；免疫细胞表达抗炎症和抗氧化双重作用分子核因子相关因子2含量超过2000pg/ml；以及细胞间粘附分子‑1含量超过1500pg/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过4000pg/ml。...

【技术特征摘要】
1.一种免疫细胞来源的生物美容原料的制备方法，其特征在于，所述方法包括通过从培养人免疫细胞的培养液和裂解人免疫细胞获得的蛋白悬液，经超浓缩后制备成免疫细胞精华液；经冷冻干燥后制备成冻干粉，可以长期在-80℃超低温冰箱保存；其中，免疫细胞的培养使用无血清培养基，优选其含0.1-200μg/ml氢化可地松、1-500μg/ml抗坏血酸和1-1000μg/ml人胰岛素。所述免疫细胞精华液或冻干粉可用作生物美容原料；所述免疫细胞培养液、含免疫细胞裂解液的培养液及其浓缩液富含白介素12(interleukin 12，IL-12)、白介素8(interleukin 8，IL-8)、白细胞介素-1受体拮抗剂(interleukin 1 receptor antagonist，IL-1Ra)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、超氧化歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、核因子相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、中性粒细胞胞浆因子2(NCF-2)；培养人免疫细胞的培养液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测，其中，抗炎症分子白介素12含量超过10000pg/ml，白介素8含量超过100000pg/ml和白细胞介素-1受体拮抗剂含量超过5000pg/ml；抗氧化因子转化生长因子含量超过7000pg/ml和超氧化歧化酶含量超过2000pg/ml；免疫细胞表达抗炎症和抗氧化双重作用分子核因子相关因子2含量超过2000pg/ml；以及细胞间粘附分子-1含量超过1500pg/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过4000pg/ml。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测，含免疫细胞裂解液的培养液中抗炎症分子白介素12含量超过20ng/ml，白介素8含量超过150ng/ml和白细胞介素-1受体拮抗剂含量超过15ng/ml；抗氧化因子转化生长因子β1含量超过13ng/ml和超氧化歧化酶含量超过5ng/ml；抗炎症和抗氧化双重作用分子核因子相关因子2含量超过5ng/ml；以及细胞间粘附分子-1含量超过3ng/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过6ng/ml。3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，经酶联免疫吸附
\t测定ELISA试剂盒检测，培养免疫细胞的培养液中分泌的抗炎症分子白介素12含量超过10000pg/ml，白介素8含量超过100000pg/ml和白细胞介素-1受体拮抗剂含量超过5000pg/ml；抗氧化因子转化生长因子β1含量超过7000pg/ml和超氧化歧化酶含量超过2000pg/ml，以及细胞间粘附分子-1含量超过1500pg/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过4000pg/ml。或/和，含免疫细胞裂解液的培养液中抗炎症分子白介素12含量超过20ng/ml，白介素8含量超过150ng/ml和白细胞介素-1受体拮抗剂含量超过15ng/ml；抗氧化因子转化生长因子β1含量超过13ng/ml和超氧化歧化酶含量超过5ng/ml；抗炎症和抗氧化双重作用分子核因子相关因子2含量超过5ng/ml，以及细胞间粘附分子-1含量超过3ng/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过6ng/ml。或/和，浓缩液中抗炎症分子白介素12含量超过100ng/ml，白介素8含量超过400ng/ml和白细胞介素-1受体拮抗剂含量超过60ng/ml；抗氧化因子转化生长因子β1含量超过50ng/ml和超氧化歧化酶含量超过20ng/ml；抗炎症和抗氧化双重作用分子核因子相关因子2含量超过20ng/ml，以及细胞间粘附分子-1含量超过6ng/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过11ng/ml。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞来源人外周血或脐带血，经淋巴细胞分离液密度梯度离心后获得单个核细胞；培养方法为：使用细胞因子干扰素γ、抗人CD3单抗、白介素1α和白介素2在无血清培养基中连续培养20天获得细胞因子诱导杀伤细胞及其培养液；或通过细胞因子白介素15、白介素18和白介素2在无血清培养基中连续培养20天获得自然杀伤细胞及其培养液；或通过细胞因子白介素15和α-GalCer在无血清培养基中连续培养20天获得自然杀伤T淋巴细胞及其培养液。所述无血清培养基含0.1-200μg/ml氢化可地松、1-500μg/ml抗坏血酸和1-1000μg/ml人胰岛素。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如
\t下步骤：将获得免疫细胞进行计数，取109细胞加入1-10ml 1×PBS混匀后并加入0.1-5ug蛋白酶抑制剂，放置于冰上在超声破碎仪中破碎3-10分钟，高速15000转每分种(rpm)离心20min，取上清加入到1L培养过免疫细胞的培养液中；再将该免疫细胞裂解液的培养液通过100-1000分子量的透析袋进行透析浓缩，或者通过100-1000分子量的醋酸纤维素膜进行超滤浓缩，浓缩1-10倍，获得100ml-500ml浓缩液；取1-5ml浓缩液加入到西林瓶中，在冷冻干燥仪中冷冻干燥得到冻干粉，压盖密封后贴签，放置-80℃冰箱保存。6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述人免疫细胞为细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T淋巴细胞、B淋巴细胞或树突状细胞；优选地，其为细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞或自然杀伤T淋巴细胞；所述免疫细胞培养液，优选地为含免疫细胞裂解液的培养液的浓缩液。7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述冻干粉作为生物美容原料，添加到面霜、润肤露或爽肤水中生产成相关产品；其制备方法为，取1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建勋，黄启明，廖文敏，
申请(专利权)人：紫程瑞生会北京生物技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11