产生同种异体移植相容的T细胞的方法技术

本发明专利技术涉及工程化的T细胞，其制备方法及其作为药物、特别是用于免疫疗法的用途。本发明专利技术的工程化的T细胞特征在于β2‑微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)的表达受到抑制，例如，通过使用能够通过DNA切割选择性失活编码B2M和/或CIITA的基因的稀切核酸内切酶，或通过使用抑制B2M和/或CIITA表达的核酸分子。为了进一步赋予T细胞非同种反应性，至少一个编码T细胞受体组件的基因被失活，例如，通过使用能够通过DNA切割选择性失活编码所述TCR组件的基因的稀切核酸内切酶。另外，可以在这些修饰的T细胞上实施免疫抑制性多肽的表达以延长这些修饰的T细胞在宿主生物体中的存活。这种修饰的T细胞特别适合于同种异体移植，由其是因为它既降低了被宿主的免疫系统的排异风险，又降低了发展移植物抗宿主病的风险。本发明专利技术开辟了使用T细胞用于治疗癌症、感染和自身免疫性疾病的标准和可承受的继承性免疫疗法策略的途径。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及工程化的T细胞，它们的制备方法及它们作为药物、特别是用于免疫疗法的用途。本专利技术的工程化的T细胞特征在于β2-微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)的表达受到抑制，例如，通过使用经DNA切割编码B2M和/或CIITA的基因而能够选择性失活的稀切核酸内切酶，或通过使用抑制B2M和/或CIITA的表达的核酸分子。为了进一步赋予T细胞非同种反应性(non-alloreactive)，至少一个编码T细胞受体组件的基因被失活，例如，通过使用经DNA切割编码所述TCR组件的基因而能够选择性失活的稀切核酸内切酶。另外，可以在这些修饰的T细胞上进行免疫抑制性多肽如病毒MHCI同源物或NKG2D配体的表达的步骤以便延长这些修饰的T细胞在宿主生物体中的存活。这种修饰的T细胞特别适合于同种异体移植，由其是因为它既降低了由宿主免疫系统排异的风险又降低了发展移植物抗宿主病的风险。本专利技术开辟了使用T细胞用于治疗癌症、感染和自身免疫性疾病的标准的和可承受的继承性免疫疗法策略的途径。
技术介绍
继承性免疫疗法，涉及离体(ex vivo)产生的自体抗原特异性T细胞的转移，是治疗病毒感染和癌症的有前途的策略。可以通过抗原特异性T细胞的扩增或通过遗传设计的T细胞重定向产生继承性免疫疗法使用的T细胞(Park，Rosenberg et al.2011)。通过转基因的T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移而成功产生T细胞中的新特异性(Jena，Dotti et al.2010)。CAR是由这样的靶向部分组成的合成受体：该靶向部分与在单个融合分子中的一个或多个信号结构域相关。一般而言，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，包括由柔性接头连接的单克隆抗体的轻的和可变的片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功使用。用于第一代CAR的信号结构域源自CD3ζ或Fc受体γ链的细胞质区域。已证明第一代CAR成功地重定向了T细胞的细胞毒性，然而，它们没能提供在体内的(in vivo)延长的扩增和抗肿瘤活性。来自包括CD28、OX-40(CD134)和4-1BB(CD137)在内的共刺激分子的信号结构域已被单独加入(第二代)或组合加入(第三代)以增强存活率和提高CAR修饰的T细胞的增殖。CAR已经成功地使T细胞重定向于表达于来自包括淋巴瘤和实体肿瘤在内的各种的恶性肿瘤的肿瘤细胞表面上的抗原(Jena，Dotti et al.2010)。使用继承性免疫疗法治疗患者的目前方案基于自体细胞转移。在这种方法中，从患者中回收T淋巴细胞，离体遗传修饰或选择，体外培养而必要时扩增细胞数量，并最后输注到患者体内。除了淋巴细胞输注之外，可以以支持T细胞的植入或它们在免疫应答中的参与的其他方式操纵宿主，这些方式例如是(用辐射或化疗)预调节和给予淋巴细胞生长因子(如IL-2)。每个患者接收单独制备的治疗，使用患者的自身淋巴细胞(即自体疗法)。对于实际应用，自体疗法面临大量技术性后勤障碍，它们的产生需要昂贵的专用设备和专家人员，它们必须在患者的诊断之后很短的时间内产生，并且在许多情况下，患者的预治疗已经导致了退化的免疫功能，而使患者的淋巴细胞可能功能不良并以非常低的数量存在。因为这些障碍，每个患者的自体细胞制备实际上是一种新产品，从而在效力和安全性方面产生大幅变化。在理想情况下，人们希望使用标准化的疗法，其中同种异体治疗细胞能够预先制备，详细表征，并可用于立即给予于患者。对于同种异体，它是指获自属于相同物种但遗传上相异的个体的细胞。然而，使用同种异体细胞目前存在很多缺点。在免疫活力的宿主中，同种异体细胞迅速受到排异，这是一种称为宿主抗移植物排异(HvG)的过程，而这基本限制了转移细胞的效力。在免疫无活力的宿主中，能够植入同种异体细胞，但它们的内源性T细胞受体(TCR)特异性可能将宿主组织识别为外来物，导致移植物抗宿主病(GvHD)，这可能会导致严重的组织损伤和死亡。为了提供同种异体T细胞，本专利技术人先前公开了遗传设计T细胞的方法，其中，通过使用以商标TALENTM(Cellectis，8，rue de la Croix Jarry，75013PARIS)更广为人知的特异性TAL核酸酶失活不同的效应子基因，具体而言是编码T细胞受体的那些。已经证明在使用RNA转染作为容许同种异体T细胞规模生产的平台的部分时在原代细胞中这种方法是高度有效的(WO 2013/176915)。β-2微球蛋白，也称为B2M，是MHC I类分子的轻链，并因此是主要组织相容性复合体的不可缺少的部分。在人类中，由位于15号染色体上、与在6号染色体上以基因簇定位的其他MHC基因相对的b2m基因编码B2M。人类蛋白由119个氨基酸(SEQ ID NO:1)组成，并具有11.800道尔顿的分子量。β-2微球蛋白缺陷的鼠模型已经证明，B2M是MHC I类的细胞表面的表达和肽结合槽的稳定性所必需的。这进一步表明，由于β-2微球蛋白基因中的靶向的突变，来自正常细胞表面MHC I类表达缺陷的小鼠的造血移植物(haemopoietic transplant)受到正常小鼠中的NK1.1+细胞排异，提示MHC I分子表达的缺失导致易受宿主免疫系统排异的骨髓细胞(Bix et al.1991)。CIITA蛋白(SEQ ID NO:4-NCBI参考序列：NP_000237.2)充当了II类主要组织相容性复合体基因转录(包括β2m基因转录)的正调节子，并通常称为是这些基因表达的“主控制因子”。CIITA mRNA(SEQ ID NO:5)只能在人类白细胞抗原(HLA)系统II类阳性细胞系和组织中检测到。这种高度受限的组织分布提示HLA II类基因的表达很大程度上受控于CIITA(Mach B.，et al.1994)。继承性免疫应答是其中众多的细胞组件相互作用的复杂生物系统。专门的抗原呈递细胞(APC)能够处理异物并在MHC II类分子的情况下将异物暴露于辅助性T细胞。激活的辅助性T细胞会反过来刺激B细胞应答和细胞毒性T(CTL)细胞应答。CTL识别由MHC I类分子呈递的外源肽，但在同种异体反应性的情况下，识别和杀死带有外源MHC I类的细胞。MHC I类分子是由2个实体组成：高度多态性的跨膜重链和小的不变多肽，由B2M基因编码的β2-微球蛋白(β2-m)。MHC I类重链在细胞表面上的表达需要其与β2-m的关联。因此，在CAR T细胞中终止(abrogation)β2-M的表达会损害MHC I类的表达并且使得它们对宿主CTL是不可见的。然而，MHC I类缺陷型CASR T细胞易于被宿主NK细胞裂解，这些宿主NK细胞靶向缺陷的MHC I类分子的细胞[Ljunggren HG et al.(1990)，Immunl Today.11:237-244]。NK细胞向与其相互作用的细胞基于它们通过不同单态或多态性受体收到的激活和抑制信号之间的平衡发挥细胞毒性功能。人类NK细胞上的一个中心的活化受体是NKG2D并且其配体包括诸如MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的蛋白质[Raulet DH，(2003)，Nature Review本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备工程化的T细胞的方法，包括以下步骤：a)提供T细胞；和b)通过使用能够通过DNA切割选择性失活编码B2M和/或CIITA的基因的稀切核酸内切酶抑制β2‑微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)在所述T细胞中的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.11 DK PA2014701191.一种制备工程化的T细胞的方法，包括以下步骤：a)提供T细胞；和b)通过使用能够通过DNA切割选择性失活编码B2M和/或CIITA的基因的稀切核酸内切酶抑制β2-微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)在所述T细胞中的表达。2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使用能够通过DNA切割选择性失活编码B2M的基因的稀切核酸内切酶实施步骤b)。3.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使用能够通过DNA切割选择性失活编码CIITA的基因的稀切核酸内切酶实施步骤b)。4.根据权利要求1至权利要求3中任一项所述的方法，其中，通过使用TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶实施步骤b)。5.根据权利要求4所述的方法，其中，使用TAL核酸酶实施步骤b)。6.根据权利要求4所述的方法，其中，通过使用RNA指导的核酸内切酶实施步骤b)。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述RNA指导的核酸内切酶是Cas9。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：c)失活至少一个编码T细胞受体(TCR)的组件的基因。9.根据权利要求8所述的方法，其中，通过使用能够通过DNA切割、优选双链断裂选择性失活至少一个编码T细胞受体(TCR)的组件的基因的稀切核酸内切酶实施步骤c)。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述稀切核酸内切酶是TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶，比如Cas9/CRISPR。11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中，所述TCR的组件是TCRα。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：d)向所述T细胞中引入包含对针对至少一个表达于恶性或受感染细胞的表面上的抗原的嵌合抗原受体(CAR)编码的核苷酸序列的外源核酸分子。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体针对B-淋巴细胞抗原CD19。14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体针对：选自分化分子的簇的抗原如CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123和CD138，肿瘤相关的表面抗原，如ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)和腱生蛋白C的A1结构域(TnC A1)和成纤维细胞相关蛋白(fap)；谱系特异性或组织特异性的抗原如CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269，TNFRSF17)，多发性骨髓瘤或淋巴母细胞白血病抗原，如选自TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)的之一，病毒特异性的表面抗原如HIV特异性的抗原(如HIV gp120)；EBV特异性的抗原，CMV特异性抗原，HPV特异性抗原，拉沙病毒特异性抗原，流感病毒特异性抗原以及这些表面抗原的任何衍生物或变体。15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，进一步包括以下的步骤：d’)表达至少一个非内源性免疫抑制性多肽。16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述非内源性免疫抑制性多肽是病毒MHC同源物。17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述病毒MHC同源物是UL18。18.根据权利要求15至权利要求17中任一项所述的方法，其中，所述非内源性免疫抑制性多肽含有与SEQ ID NO:89共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％的同一性的氨基酸序列。19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述非内源性免疫抑制性多肽是NKG2D配体。20.根据权利要求15或19所述的方法，其中，所述非内源性免疫抑制性多肽含有与SEQ ID NO:90-97中任一项共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％的同一性的氨基酸序列。21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：e)扩增所获得的工程化的T细胞。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，步骤a)中的所述T细胞衍生自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞。23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述T细胞衍生自CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞。24.一种工程化的、优选分离的T细胞，其中，所述T细胞表达能够通过DNA切割选择性失活编码B2M的基因的稀切核酸内切酶。25.一种工程化的、优选分离的T细胞，其中，所述T细胞表达能够通过DNA切割选择性失活编码CIITA的基因的稀切核酸内切酶。26.根据权利要求24或25所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞包含含有编码所述稀切核酸内切酶的核苷酸序列的外源核酸分子。27.根据权利要求26所述的工程化的T细胞，其中，所述稀切核酸内切酶是TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶。28.根据权利要求27所述的工程化的T细胞，其中，所述稀切核酸内切酶是TAL核酸酶。29.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳伦特·普瓦罗，戴维·苏尔迪夫，菲利普·迪沙泰奥，让皮埃尔·卡巴尼奥尔，
申请(专利权)人：塞勒克提斯公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR