具有共价结合肽的重组T细胞受体配体制造技术

本文公开了含有通过二硫键与抗原决定簇共价连接的MHC?I类或MHC?II类重组体T细胞受体配体RTL多肽的稳定复合物。还公开了制备该组合物的方法和使用方法，例如用于治疗或抑制疾病，例如自身免疫性疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及包含共价连接有肽抗原的主要组织相容性复合物(MHC)多肽的组合物和使用这些组合物以例如调节免疫应答的方法。
技术介绍
哺乳动物对特异性抗原免疫应答的起始由该抗原呈递至T细胞带来。在主要组织相容性复合物(MHC)的情形中，抗原被呈递至T细胞。MHC复合物位于抗原呈递细胞(APC)的表面上；MHC的三维结构包括适合所呈递抗原进入的沟(groove)或裂隙(cleft)。当在存在必需共刺激信号的情况下T细胞上的合适受体与APC上的MHC/抗原复合物相互作用时，所述T细胞被刺激，触发免疫系统激活事件的充分表征的级联的多个方面，包括诱导细胞毒性T细胞功能，诱导B细胞活性和刺激细胞因子产生。哺乳动物中存在两类基本的MHC分子，MHC I类和MHC II类。这两类都是由两个独立的蛋白缔合 形成的大蛋白复合物。每类都包括将所述复合物锚定至细胞膜的跨膜结构域。MHC I类分子由两个非共价缔合的蛋白——α链和β 2-微球蛋白——形成。所述α链包含三个不同的结构域:α 1、α 2和α 3。所述α I结构域和α 2结构域的三维结构形成适合抗原进入用于呈递到T细胞的沟。所述α 3结构域是Ig-折叠样结构域，其含有将α链锚定至APC细胞膜中的跨膜序列。当与抗原缔合时(并且在合适的共刺激信号的存在下)，MHC I类复合物可刺激CD8细胞毒性T细胞，所述细胞起到杀死其特异性识别的任何细胞的作用。所述非共价缔合形成MHC II类分子的两个蛋白被称为α链和β链。所述α链包含αI结构域和α 2结构域，所述β链包含βI结构域和β 2结构域。适合抗原进入的裂隙通过所述αI结构域和βI结构域的相互作用形成。所述α 2结构域和β 2结构域是将所述α链和β链锚定至APC的细胞膜中的跨膜Ig-折叠样结构域。当与抗原缔合时(并且在存在合适的共刺激信号的情况下)，MHC II类复合物可刺激⑶4Τ细胞。⑶4Τ细胞在免疫系统内起多种作用，包括起始炎症应答，调节其他免疫细胞，帮助B细胞进行抗体合成，调制免疫应答以实现对给定抗原的合适免疫应答，分泌细胞因子和/或表达膜结合因罕坐丁寸οMHC复合物在免疫系统中起的作用已导致开发了将这些复合物用于调节免疫应答的方法。例如，在MHC的情形中，可识别“自身”抗原肽(自身抗原)的活化T细胞在自身免疫性疾病(例如类风湿关节炎和多发性硬化)中起关键作用。因为分离的MHC II类分子(装载有合适的抗原)可替换携带MHC II类复合物的APC并且可结合抗原特异性T细胞，许多人已提出分离的MHC/抗原复合物可用于治疗自身免疫性疾病(参见美国专利N0.5，194，425和 5，284，935)。在另一种情形中，已经表明在缺乏共刺激因子的情况下，分离的MHCII/抗原复合物与T细胞的相互作用可诱导称为无反应性的无应答状态(Quill et al，J.1mmunol.，138:3704-3712，1987)。根据该现象，Sharma 等人(美国专利 N0.5，468，481 和5，130, 297)和Clarke等人(美国专利N0.5，260, 422)已经提出，可在治疗上给予这类分离的MHC 11/抗原复合物以使得对特定自身抗原肽特异性应答的T细胞系无反应。
技术实现思路
虽然使用分离的MHC/抗原复合物的概念在治疗和诊断应用中具有很好的前景，但是到目前为止报道的各种方法的主要缺点是该复合物是大体积的并因此难于产生和操作。本文表明，重组MHC多肽(例如重组的两个结构域MHC I类多肽或MHC II类多肽)可被共价连接到肽抗原上以产生稳定的复合物。本文公开了含有通过二硫键与抗原决定簇共价连接的MHC I类或MHC II类重组T细胞受体配体(RTL)多肽的稳定复合物。还公开了制备这类组合物的方法和使用方法，例如治疗或抑制自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所公开的组合物包括含有共价连接的第一结构域和第二结构域的重组MHC多肽以及通过二硫键与所述MHC多肽共价连接的抗原决定簇(例如肽抗原)，其中所述第一结构域是哺乳动物MHC II类β I结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC II类α I结构域，其中所述α I结构域的氨基端与所述β I结构域的羧基端共价连接，其中所述MHC II类多肽不包括α2或β 2结构域。在其 他实施方案中，所公开的组合物包括含有共价连接的第一结构域和第二结构域的重组MHC多肽以及通过二硫键与所述MHC多肽共价连接的抗原决定簇(例如肽抗原)，其中所述第一结构域是哺乳动物MHC I类α I结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC I类α 2结构域，其中所述α 2结构域的氨基端与所述α I结构域的羧基端共价连接，其中所述MHC I类多肽不包括α 3结构域。在一些实例中，所述重组MHC多肽在溶液中聚集的倾向降低，例如这样的重组MHC多肽，即在所述MHC多肽的极性氨基酸或荷电氨基酸的β折叠平台(platform)中包括一个或多个疏水性氨基酸置换。在一些实例中，利用所述MHC多肽中天然存在的半胱氨酸残基(例如MHC II类β 结构域的半胱氨酸残基或MHC I类α结构域的半胱氨酸残基)形成二硫键。在其他实例中，利用所述MHC多肽中非天然存在的半胱氨酸残基(例如通过诱变引入至所述MHC多肽的半胱氨酸残基)形成二硫键。在其他实例中，利用所述抗原决定簇中天然存在的半胱氨酸残基形成二硫键。仍在其他实例中，利用所述肽抗原中非天然存在的半胱氨酸残基(例如通过诱变引入至所述抗原决定簇的半胱氨酸残基)形成二硫键。本文还公开了制备所公开组合物的方法和用于产生所公开组合物的试剂盒。在一些实例中，所述方法包括使用含有一种或多种组分的缓冲液或溶液，以帮助(例如提供充分的条件)在所述重组MHC多肽和所述抗原决定簇之间形成二硫键。本文还提供了使用所公开组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括治疗或抑制受试者中自身免疫性疾病(包括给予有效量的含有通过二硫键与抗原决定簇共价连接的本文公开的重组MHC多肽的组合物)。在具体的实例中，所述自身免疫性疾病包括但不限于多发性硬化、I型糖尿病、类风湿关节炎、乳糜泻或银屑病。根据以下的具体实施方式，本公开的上述特征和其他特征将变得更加明显，所述具体实施方式参考附图进行。附图说明图1A是示出“空的”rIAg7 (_)和带有二硫键(disulfide)捕获的胰岛素B:9_23肽的rIAg7 (WT)的考马斯蓝染色的10-20%SDS-PAGE的数字图像。rIAg7/肽作为高分子量种类(29kD、31kD和33kD)迁移。装载样品和处理条件如所示(Red，还原性；NR，非还原性)。图1B的条状图示出对图1A的泳道7和泳道8中所示条带的定量。图2是示出对rIAg7捕获的FITC标记的胰岛素B:9-23肽和变体(如所示)对比的数字图像。rIAg7对野生型胰岛素B:9-23肽(C19)的捕获最有效。如图所示，半胱氨酸移向氨基端(移至第18位；C18)或移向羧基端(移至第20位；C20)的胰岛素B:9-23变体即使在孵育50小时之后仍被捕获，但是效率低很多。肽序列在数字图像下面示出。图3是示出rIAg7捕获肽的时间过程的两张数字图像。在IOOmM NaPO4 (pH6.5)、150mM NaCl、0.05%SDS和0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.03 US 61/380,1911.一种组合物，包含: 含有共价连接的第一结构域和第二结构域的分离的重组MHC多肽和通过二硫键与所述重组MHC多肽的第一结构域共价连接的抗原决定簇，其中: 所述第一结构域是哺乳动物MHC II类β I结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC II类α I结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC II类分子不包括α 2结构域或β 2结构域；或 所述第一结构域是哺乳动物MHC I类α I结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC I类α 2结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC I类分子不包括α 3结构域。2.权利要求1的组合物，其中所述二硫键包含所述抗原决定簇中的半胱氨酸残基和所述重组MHC多肽的第一结构域中的半胱氨酸残基之间的二硫键。3.权利要求2的组合物，其中所述重组MHC多肽的第一结构域包含βI结构域，所述半胱氨酸残基包含半胱氨酸17、半胱氨酸79或它们的组合。4.权利要求1-3任一项的组合物，其中所述重组MHC多肽的第一结构域和第二结构域之间的共价连接包含肽接头。5.权利要求4的组合物，其中所述肽接头的长度为至少6个氨基酸。6.权利要求1-5任一项的组合物，其中所述抗原决定簇包含肽抗原。7.权利要求6的组合物，其中所述抗原决定簇包含8-35个氨基酸。8.权利要求1-7任一项的组合物，其中所述抗原决定簇包括M0G35-55、胰岛素Β:9-23或PLP139-151。9.权利要求1-8任一项的组合物，其中所述抗原决定簇的半胱氨酸残基包含非天然存在的半胱氨酸，所述重组MHC多肽的第一结构域的半胱氨酸残基包含非天然存在的半胱氨酸，或者它们的组合。10.权利要求1-9任一项的组合物，其中所述重组MHC多肽在溶液中的聚集倾向降低。11.权利要求10的组合物，其中所述重组MHC多肽包括DR2MHCβ Ia I多肽，所述重组MHC多肽含有一个或多个疏水性残基被极性残基或荷电残基置换，其中所述一个或多个残基选自SEQ ID NO: 11的V102、I104、A106、F108和L110，从而与未改性的重组MHC多肽相比在溶液中的聚集降低。12.权利要求1-11任一项的组合物，还包含可药用载体。13.一种治疗或抑制受试者中选自以下的疾病的方法:自身免疫性疾病、视网膜疾病、葡萄膜炎、中风和由药物成瘾引起的认知损伤或神经精神障碍，所述方法包括:给予所述受试者有效量的权利要求1-12任一项的组合物,从而治疗或抑制...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·G·伯罗斯，
申请(专利权)人：俄勒冈健康科学大学，
类型：
国别省市：