脐带血样品稀释液、试剂盒及处理脐带血获得干细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种体外分离脐带血干细胞的稀释液、试剂盒及分离干细胞的方法。通过细胞稀释剂、细胞沉淀剂和分层剂的配合使用，能够快速分离出脐带血中的干细胞，且分离出来的干细胞活性高，杂质细胞少，在临床应用上具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
脐带血样品稀释液、试剂盒及处理脐带血获得干细胞的方法
本专利技术属于生物技术应用领域，具体地涉及一种体外分离脐带血样品的稀释液、试剂盒及处理脐带血获得干细胞的方法。
技术介绍
脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗80多种疾病。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源。因此，脐带血是一种非常重要的人类生物资源。目前，从脐带血、骨髓和外周血中分离提取干细胞的方法包括以下几种：体外扩增培养法、血细胞分离机法、免疫磁珠法、流式细胞仪法等。然而，这些方法中均存在若干缺点。例如，体外扩增培养法污染率较高，干细胞向未知方向分化为未知干细胞，且扩增时间长。血细胞分离机法需要打动员剂增加治疗负担，分离后细胞液体积过大。免疫磁珠法操作步骤复杂，细胞活性低，细胞浓度低。流式细胞仪法成本高，标记物有致癌性，应用于临床不安全，只能适用于科研。针对现有技术的不足，已公开了如下技术：CN101089176A公开了一种干细胞分离液及其用于干细胞分离的方法。然而该方法需要配制工作液，需要调节密度，而且只能搜集密度在1.083g/ml范围内的细胞，搜集到的细胞较杂，而可用于治疗所需要的目标细胞数量少，并且对于脐带血来说，使用该方法去除红细胞不净，最终临床应用的时候会导致患者产生排异反应。CN1948467A的专利申请中公开了用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。虽然使用该试剂盒可以直接分离血液中的干细胞，但是数量不足以临床治疗使用，所以该方法进行了细胞培养，培养的细胞污染率高，体外模拟体内环境使细胞扩增，导致培养出的细胞有形态没功能，不能用于临床治疗。CN102604892A的专利申请中公开了一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞处理试剂盒及干细胞分离方法。然而该技术获得的干细胞的数量占细胞总数量的比例较低，且存活率不高。总之，现有技术中仍然存在对于新的脐带血干细胞分离技术的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的缺陷，提供了一种操作简便、使用安全、细胞活性高、杂质细胞少的脐带血分离技术。具体地，本专利技术的一方面，提供一种脐带血样品稀释液，其由氯化钠、细胞保护剂和水组成，其中：所述氯化钠的含量为0.1-5重量％；所述细胞保护剂的含量为0.1-3重量％；余量为水；所述细胞保护剂由80-90重量％的氨基酸、8-18重量％的磷脂、0.5-2重量％的腺嘌呤和0.1-3重量％的肽类生长因子组成；所述氨基酸选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的至少一种。在某一实施方案中，所述细胞保护剂由84重量％的氨基酸、14重量％的磷脂、1重量％的腺嘌呤和1重量％的肽类生长因子组成。在某一实施方案中，所述细胞保护剂的含量为2重量％。在某一实施方案中，所述氯化钠的含量为0.9重量％。本专利技术的另一方面，提供脐带血干细胞处理试剂盒，其由彼此独立存在的细胞稀释剂、细胞沉淀剂和分层剂组成，其中：所述细胞稀释剂为本专利技术所述的脐带血样品稀释液，所述细胞沉淀剂为4-10重量％的羟乙基淀粉水溶液，所述分层剂为由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2g/ml的水溶液。本专利技术的再一方面，提供处理脐带血获得干细胞的方法，其包括：将脐带血样品与细胞稀释剂接触的步骤；随后加入细胞沉淀剂的步骤；待分层后取出上层细胞液离心浓缩获得沉淀，将沉淀铺到分层剂上层，然后离心分离得到干细胞层的步骤；其中：所述细胞稀释剂为本专利技术中所述的脐带血样品稀释液。优选地，所述细胞沉淀剂为4-10重量％的羟乙基淀粉水溶液。优选地，所述分层剂为由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2g/ml的水溶液。在某一实施方案中，处理脐带血获得干细胞的方法包括：将脐带血样品加入到含有所述细胞稀释剂的培养液瓶中；再加入所述细胞沉淀剂，混合均匀后，静置；待分层后取出上层细胞液离心浓缩后，将沉淀铺到分层剂上层，然后离心分离得到干细胞层。在某一实施方案中，所述离心浓缩的转速为1000-2000转/分钟，离心时间为10-30分钟。本专利技术采用的脐带血样品稀释剂作为细胞稀释剂，配合细胞沉淀剂和分层剂使用，能够更好的分理出脐带血中的干细胞，且所获得的干细胞相比于其他方法和试剂分离出的干细胞的存活率高，且含有杂质细胞更少。具体地，与现有技术相比，本专利技术的优点包括：1、本专利技术的试剂和方法针对性强，对于脐带血效果最佳。2、干细胞存活率高，且所含杂质细胞少。3、成本低，所需试剂或材料简单容易得到。4、对环境及干细胞本身不会产生任何污染，能够很好的用于临床应用。5、本专利技术提供的试剂液可以产业化生产，使用便捷。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。本专利技术中所述的“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。应理解本公开中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本公开的内容。另外，对于本公开中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本公开所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。本专利技术中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。本专利技术中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。本专利技术中，所述的“脐带血”是指哺乳动物(例如，人类)胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。在一个实施方案中，胎盘和脐带可从动物体分离后经冷冻保存。在另一实施方案中，胎盘和脐带为从动物体分离的新鲜胎盘和脐带。优选地，胎盘和脐带为从动物例如人体分离后1-12小时，优选1-5小时之内的胎盘和脐带。新鲜的胎盘和脐带具有更多高活性的干细胞。因此，本专利技术的脐带血优选为新鲜胎盘和脐带中的血液。本专利技术中，术语“脐带血样品稀释液”(本文中有时也简称为“稀释液”)是由氯化钠、细胞保护剂和水组成的水溶液，其pH值需要保持在6.8至7.2范围内，优选保持于7.0。稀释液用于将脐带血样品进行稀释，从而获得所需浓度或密度的血液样品。稀释液的配制方法不特别限定，例如在市售氯化钠注射液中添加所需量的细胞保护剂，并溶解均匀。优选地，进一步包括无菌处理的步骤，例如，加热灭菌处理步骤，或者过滤除菌的步骤。考虑到加热处理可能影响稀释液成分的稳定性，优选过滤除菌的方法。本专利技术中，所述术语“细胞保护剂”是指对细胞起保护作用的试剂。具体地，本专利技术的细胞保护剂由氨基酸、磷脂、腺嘌呤和肽类生长因子组成。基于稀释液的总重量，细胞保护剂的含量通常在0.1-3重量％范围内。优选为0.5-2.5重量％，更优选为2重量％。本专利技术中，基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脐带血样品稀释液，其由氯化钠、细胞保护剂和水组成，其中：所述氯化钠的含量为0.1‑5重量％；所述细胞保护剂的含量为0.1‑3重量％；余量为水；所述细胞保护剂由80‑90重量％的氨基酸、8‑18重量％的磷脂、0.5‑2重量％的腺嘌呤和0.1‑3重量％的肽类生长因子组成；所述氨基酸选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种脐带血样品稀释液，其由氯化钠、细胞保护剂和水组成，其中：所述氯化钠的含量为0.1-5重量％；所述细胞保护剂的含量为0.1-3重量％；余量为水；所述细胞保护剂由80-90重量％的氨基酸、8-18重量％的磷脂、0.5-2重量％的腺嘌呤和0.1-3重量％的肽类生长因子组成；所述氨基酸选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的至少一种。2.根据权利要求1所述的脐带血样品稀释液，其中所述细胞保护剂由84重量％的氨基酸、14重量％的磷脂、1重量％的腺嘌呤和1重量％的肽类生长因子组成。3.根据权利要求1或2所述的脐带血样品稀释液，其中所述细胞保护剂的含量为2重量％。4.根据权利要求1或2所述的脐带血样品稀释液，其中所述氯化钠的含量为0.9重量％。5.一种脐带血干细胞处理试剂盒，其由彼此独立存在的...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐明淇，赵涌，
申请(专利权)人：北正赛欧北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11