一种CHO-Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法技术方案

本发明专利技术涉及细胞工程领域，具体涉及一种CHO‑Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法。该方法采用氨甲喋呤三轮加压，选择细胞活力在40％～50％的细胞池，在特定的半固体培养基中进行单克隆化，该方法克隆形成率显著提高，且能够在较短时间内筛选出更多的表达量高且稳定的菌株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞工程领域，具体来说，涉及一种CHO-Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法。技术背景用于单克隆抗体或者分子量较大的重组蛋白药物生产的“工程细胞”系需具备以下特性：生长特性良好，无血清悬浮培养密度高(1～2×107cell/ml)；异源蛋白表达能力强(20～70pg/cell/day，pcd)，具备正确的翻译后修饰能力；宿主及重组细胞系遗传背景清晰、表型稳定，符合相关法规要求。目前，业内细胞系构建中最常用的筛选体系之一是CHO-Dhfr系统。CHO细胞即中华仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary)，DHFR是指二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase)，催化二氢叶酸转还原为四氢叶酸，DHFR基因敲除的CHO细胞(如Invitrogen的DG44)不能合成四氢叶酸，只能在添加胸苷、甘氨酸和嘌呤的培养基中生长。该系统是将外源基因插入到含有DHFR基因表达载体的下游，并转入至宿主细胞DG44细胞，这样便可在不含胸苷、甘氨酸和嘌呤的培养基中生长。在细胞培养时添加DHFR的抑制剂氨甲蝶呤(methotrexate，MTX)，使MTX基因及与之相连的目的基因一起扩增，达到增加目的基因拷贝数，从而提高目的基因表达水平的目的。细胞株筛选的目的在于获得稳定高产的细胞株，其衡量标准包括抗体表达量、产品质量、代谢稳定性、细胞基质稳定性等。常规的筛选方法是：表达构建体的构建→转染至宿主细胞→加压筛选获得细胞池→细胞池(cellpool)的单克隆化→高表达细胞株扩大培养及筛选→细胞株的稳定性评估。细胞池常规获得的方法是：当表达构建体被转染到宿主细胞内，采用多轮加压的策略，直至表达量上升幅度不大后，前一轮为最高加压轮次。将其细胞复苏后，待细胞活力>95％后即为细胞池，或者是用前面提到的细胞池做流式细胞分选表达量TOP2～5％的细胞，待细胞活力再次>95％后即为细胞池。一般来说，在同样的培养环境下，低表达细胞株将营养成分更多用在细胞生长上，故生长较快，而高表达细胞株生长较慢，因此，以上提到的两种活力>95％的细胞池在细胞活力逐渐恢复的过程中，大多数高表达细胞株越长越慢，以至于丧失；而低表达细胞株越长越快；最终导致细胞池的高表达细胞株含量低，低表达的细胞株含量高。同时，在细胞活力恢复的过程中，增加细胞传代次数，据实验经验，每经历一次细胞活力恢复，细胞增加15～20Generations(Generation，世代，细胞每倍增一次，称为1Generation)，影响细胞株的稳定性。单克隆化筛选最常规的方法是有限稀释(limitingdilutioncloning，LDC)，低成本且易于操作，即将细胞密度按照<1cell/孔铺至96孔板中，培养基为液体培养基，大多时候会按照需求添加一定比例的条件培养基(含有细胞生长因子)，对细胞生长状态要求极高，活力<90％的细胞池几乎很难存活，克隆效率极低，即使单克隆化活力>95％的细胞池，克隆效率最高也仅有7％左右，平均水平在3％～4％，且操作繁琐，工作量大，实验周期长，实验效率低，无法实现高通量筛选。用半固体培养基法进行单克隆化筛选，它是将细胞池按照一定的密度铺于半固体培养基上形成单克隆，继而挑选出来逐步扩大培养及筛选高表达细胞株。目前逐渐使用ClonePix2这类高通量筛选仪器在各种半固定培养基上进行高通量筛选，然而参照现有文献，如何提高克隆形成率及更快更易筛选出稳定高表达细胞株一直是本领域的技术难点。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种CHO-Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法，该方法克隆形成率高且易于从中筛选出稳定且表达量高的细胞株。具体的，该方法通过选择细胞活力在40％～50％细胞池，在半固体培养基上进行单克隆化，同时利用高通量细胞筛选系统，克服了通过有限稀释法克隆效率极低的问题，从而更容易筛选出稳定高表达的优质细胞株。一种CHO-Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法，包含以下步骤：(1)表达构建体的构建，(2)转染至宿主细胞，(3)MTX加压筛选获得细胞池，(4)细胞池在半固体培养基上进行单克隆化，(5)利用高通量细胞筛选系统筛选细胞株，(6)细胞株的稳定性评估。其特征在于，步骤(4)所述的细胞池的细胞活力为40％～50％。根据本专利技术的具体实施例，步骤(3)所述的MTX加压筛选分为三轮，MTX的浓度依次为100nM、1000nM、5000nM；根据本专利技术的一些实施例，步骤(4)所述在半固体培养基上进行单克隆化，其中，半固体培养基中细胞终浓度为150cells/mL；根据本专利技术的一些实施例，步骤(4)所述的半固体培养基中含有条件培养基与甲基纤维素。优选的，条件培养基占半固体培养基总体积的10％。优选的，甲基纤维素在半固体培养基中的含量为0.9～1.5g/L。根据本专利技术的一些实施例，所述条件培养基的制备方法为：取已经转染pOptiVEC(该载体含Dhfr基因，不含有其它外源蛋白的基因)的稳定细胞株在添加8mM谷氨酰胺的OptiCHOMedium中进行批培养，细胞培养至密度在0.9×107～1.1×107cells/mL之间且细胞活力>95％时，经过离心分离上清和细胞，取上清过滤后即得。其中，所述细胞株为DG44细胞。根据本专利技术的一些实施例，步骤(4)所述的半固体培养基中还含有1％体积比的荧光抗体，所述荧光抗体选自CloneDetect-anti-humanIgG(H+L)detection。根据本专利技术的一些具体实施例，步骤(5)所述高通量细胞筛选系统为MolecularDevices公司的ClonePix2。根据本专利技术的一些实施方案中，所述Dhfr表达系统为携带Dhfr基因的并且Dhfr基因下游插入了外源基因的表达载体转染至敲除了Dhfr基因的CHO细胞(DG44)。术语解释二氢叶酸还原酶(DHFR)是指利用还原型辅酶Ⅱ(NADPH)还原二氢叶酸产生四氢叶酸的氧化还原酶，四氢叶酸参与嘌呤、嘧啶的合成，对正常血细胞的生成具有促进作用，DHFR的抑制剂是氨甲喋呤(MTX)。氨甲喋呤(MTX)加压是用于DHFR表达系统以扩增Dhfr基因下游的目的基因，从而实现外源基因的高表达，在本专利技术中，用三轮大幅度加压的方式，即：100nM、1000nM、5000nM，来获取5000nMMTX加压情况下较低活力的细胞池。新霉素(neomycin)抗性基因(Neo)被整合进真核细胞DNA后，能启动Neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有新霉素抗性基因的G418的选择性培养基中生长。本专利技术使用的半固体培养基为含有10％条件培养基的半固体培养基。条件培养基提供细胞生长的营养物质，帮助克隆形成。本专利技术添加的条件培养基为本实验室自制，制备方法在实施例中描述。本专利技术使用的半固体培养基为含有甲基纤维素的半固体培养基。甲基纤维素的添加既能使同一单克隆在分裂时成一细胞团，又能使细胞分泌的抗体聚集在细胞团周围与荧光抗体(CloneDetect-anti-humanIgG(H+L)detection(MolecularDevices，货号K82本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CHO‑Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法，包含以下步骤：(1)表达构建体的构建，(2)转染至宿主细胞，(3)氨甲喋呤加压筛选获得细胞池，(4)细胞池在半固体培养基上进行单克隆化，(5)利用高通量细胞筛选系统筛选细胞株，(6)细胞株的稳定性评估；其特征在于，步骤(4)所述的细胞池的细胞活力为40％～50％。

【技术特征摘要】
1.一种CHO-Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法，包含以下步骤：(1)表达构建体的构建，(2)转染至宿主细胞，(3)氨甲喋呤加压筛选获得细胞池，(4)细胞池在半固体培养基上进行单克隆化，(5)利用高通量细胞筛选系统筛选细胞株，(6)细胞株的稳定性评估；其特征在于，步骤(4)所述的细胞池的细胞活力为40％～50％。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的氨甲喋呤加压筛选分为三轮，氨甲喋呤的浓度依次为100nM、1000nM、5000nM。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述在半固体培养基上进行单克隆化，其中，半固体培养基中细胞终浓度为150cells/mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的半固体培养基中含有条件培养基与甲基纤维素。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述条件培养基占半固体培养基总...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘静，杨彬，张彩霞，陈华林，陈莉，孙文正，李文佳，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44