本发明专利技术提供能够高效稳定表达人穹窿体蛋白的重组CHO细胞株CHO-S/MVPA，其保藏编号为CGMCC NO.8777。与现有的昆虫细胞表达系统相比，该重组CHO细胞株可以稳定而高效地表达有活性的人穹窿体蛋白(hMVP)，得到的穹窿体及其复合物产品能够广泛地应用于纳米生物技术领域，包括生物医药、生物试剂、生物涂层等等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种新型的稳定商效表达穹窿体蛋白质（Vault) 及其复合物的CHO表达体系。具体而言，本专利技术涉及一种保藏号为CGMCC NO. 8777的稳定高 效表达穹窿体蛋白质（Vault)及其复合物的CHO细胞株。依据目的蛋白应用方向的不同， 该表达体系可以有效的通过基因重组的方式构建信号肽，从而使得穹窿体及其复合物有选 择性的在CHO细胞内或者细胞外表达重组。得到的穹窿体及其复合物产品能够广泛地应用 于纳米生物
，包括生物医药、生物试剂、生物涂层等等。
技术介绍
纳米生物技术的出现融合了纳米工程学和分子生物学这两大领域的尖端技术，被 公认为是21世纪最具有前途的科研领域，在医药卫生领域有着广泛的应用和明确的产业 化前景。纳米生物技术从文献中可以看得到的应用已经涉及到药物控释材料，细胞外基质 材料，抗菌抗病毒材料，膜生物材料，组织工程（骨、软骨、血管、神经、口腔等）材料，复合支 架材料等等。正因如此，国际上像美国、日本、德国等发达国家均已将纳米生物技术作为21 世纪的科研优先项目予以重点发展。我国纳米生物技术的发展与先进国家相比，起步较晚， 但"九五"期间"863计划"启动了国家纳米振兴计划，"十五"期间"863计划"将纳米生物 技术列为专题项目予以优先支持发展。 尽管当前纳米生物技术的应用范围涉及医药研发、诊断设备试机等等诸多方向， 其核心技术在于纳米生物材料的开发与应用。纳米生物材料按照其基本构造成分来分类主 要存在如下几种：无机小分子聚合物（富勒烯，碳纳米管，碳纳米球，纳米铁颗粒），有机高 分子聚合物（脂质体，凝胶，树枝形分子聚合物，多肽聚合物），和模仿天然存在的纳米材料 (蛋白质复合物，病毒）。从开发新材料的角度来看，以上这些材料都可以具有卓越的理化 性能，表面改性性能，力学性能，耐蚀性能等相对简单的单一特性。然而，纳米生物材料的开 发除了具备这些简单的基本功能外，更应该考虑到生物体的复杂性和不可预知性，注重其 在生物体内的综合性能表现。常见的用于评价材料生物相容性指标包括，组织相容性、血液 相容性，生物安全性，生物降解性，血液-材料相互作用，免疫性能，细胞黏附性能等等。正 因如此，以上这些纳米生物材料就目前为止，其报道方向还仅限于大量的基础论文文献，距 离真正的临床研究领域还有相当长的距离。一方面，生物纳米材料得益于纳米技术在微观 角度对材料单体结构的高度可控性，从而展现出传统生物材料所难以实现的特性。例如1 : 药效功能的高度均一性；2 :携带药物的种类与数量；3 :控制药物在生物体内的生物降解性 和生物利用度；4 :生物导向和药物靶向性。另一方面，生物纳米材料因为其自身存在的外 源性和尤其是安全性问题给环境和人体健康带来大量的负面影响。事实上，对于很多新开 发的生物纳米材料的安全性方面缺乏有效的检测和评价方法是使得大量生物纳米材料停 留在基础研究方面的一个主要原因。 穹窿体的出现，有望于从根本上解决生物纳米材料在安全性的问题，从而使得这 项新技术能够在疾病的诊断、治疗和卫生保健方面发挥重要作用。穹窿体于20世纪80 年代被洛杉肌加利福尼亚大学药学院的生物学家Nancy Kedersha及生物化学家Leonard Rome首次发现并成功分离。穹窿体是高等生物体内（含人）自然存在的一种大分子核糖 核酸-蛋白质复合物，分子量约为13MDa，外形类似美式橄榄球（尺寸大约为40nmX40nm X70nm)，高等生物体内含量为每个细胞10, 000到1，000, 000个，目前已确定的组分包括三 种蛋白质（MVP，VPARP，TEP1)和一种穹窿体RNA。穹窿体在自然界的分布极为广泛，目前已 经在哺乳类动物、两栖类动物、鸟类动物及盘基网柄菌等生物的细胞中发现并分离。同源蛋 白家族数据库（Pfam database)使用的穹窿体模型识别出在第四双小核草履虫、动质体目 原生动物、众多脊椎动物、剌胞动物（星海葵）、软体动物、丝盘虫、扁形虫、细粒棘球蚴及领 边虫细胞中的同源物。有趣的是，尽管穹窿体在生物体内的含量非常的高，穹窿体的功能 却没有被完全了解，推测的功能涉及抗药性、细胞核物质运输等等。然而动物实验表明，去 除了体内穹窿体的小鼠和对照组的小鼠在包括小鼠生存试验等一系列指标评价种没有表 现出任何差异性。 穹窿体的发展主要经历了如下两个阶段：1 :1986-2001。自从穹窿体在1986年发 现以来，这一时期的主要工作围绕着穹窿体的天然功能和其基本组成结构。2 :2001-2013。 穹窿体的修饰重组结构和应用拓展。这一时期的成就主要分成两个方面a :突破了穹窿体 只能来源于动物体内的限制，成功的利用杆状病毒在昆虫细胞内（Spodoptera frugiperda Sf21cells)合成仅由MVP形成的简化版穹窿体。b:发现了穹窿体的几个修饰位点，为拓展 携带药物的种类与数量提供了可能性。然而，该昆虫细胞表达系统其自身并不存在表达穹 窿体的相应表达体系，尤其是缺乏对表达后的MVP蛋白质的进一步修饰功能，例如泛素化、 磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等等。这样得到的重组蛋白不能以正确折叠的形 态存在，重组蛋白仅能模拟母本蛋白中由相邻氨基酸残基组成的抗原决定簇，即线性表位， 不能在二、三级结构上重现人体细胞产生的穹窿体蛋白。此外，人群中为数不少者感染过各 种类型的杆状病毒，体内存在抗杆状病毒抗体，因此易发生交叉反应，严重影响穹窿体作为 生物纳米材料在安全性问题。可见，这一时期的主要问题是虽然昆虫细胞表达系统可以从 技术繁琐程度，提取数量以及消耗成本上解决许多问题，但作为一种低等表达体系，始终不 能克服自身存在的问题，表达蛋白质量不尽人意。正因如此，下一步工作发展迫切需要一个 不但能够按照GMP标准大量表达1?效并且廉价的穹窿体，而且对表达后的穹窿体MVP蛋白 质有接近于天然状态的翻译后修饰功能的表达体系。只有这样才能得到与天然的穹窿体蛋 白有更相似的理化性质和生物活性，从而使得穹窿体蛋白质及其复合物在结构更为精准， 功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一，从而达到穹窿体在疾病的诊断、治疗和卫生 保健方面应有的重要作用。 目前为止，中国仓鼠卵巢细胞系（Chinese hamster ovary cell line, CH0)是应用 最为广泛的用于生物制药的真核表达系统，早在上个世纪80年代初期就已经被世界卫生 组织（WHO)明确认可作为生物制品生产的哺乳动物细胞体系。在美国和欧盟已批准的以哺 乳动物细胞生产的生物药品中，利用CHO系统的占60%以上，且比例不断上升。中国仓鼠卵 巢细胞（Chinese Hamster Ovary, CH0)是当今工业生产上应用最多的细胞表达系统，被广泛 地用于各种类型的重组DNA蛋白的细胞内和细胞外表达。与其他表达系统相比，CHO细胞 具有如下优点：a.用CHO表达系统表达生物大分子蛋白的方法和工艺已经越来越标准化而 且被业界广泛认可b.表达蛋白的折叠及二硫键的形成几乎与天然蛋白质相同；c.在复合 特定氨基酸密码的氨基酸位点上发生糖基化；d.能完成其他翻译后加工与修饰；e.能正确 组装多亚基蛋白；f.外源基因的本文档来自技高网...
【技术保护点】
高效稳定表达人穹窿体蛋白的重组CHO细胞株，其保藏号为CGMCC NO.8777。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨健，
申请(专利权)人：天津迁昆元生物医药科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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