本发明专利技术涉及核酸构建体，其包含：编码冰结构蛋白质(ISP)的核酸序列，所述ISP包含在SEQ ID NO:1中示出的序列或者与其至少80％同一的序列，或者包含在SEQ ID NO:1的第21至261位氨基酸中示出的序列或者与其至少80％同一的序列；以及有效连接至所述冰结构蛋白质的核酸序列的控制序列，所述控制序列允许所述核酸序列在丝状真菌宿主细胞中表达。所述构建体可在产生ISP的方法中使用，其中所述ISP在丝状真菌宿主细胞中表达。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及包含编码冰结构蛋白质(ice structuring protein，ISP)的核酸序列的核酸构建体。本专利技术还涉及包含所述核酸的表达载体并且涉及包含所述核酸构建体或者所述表达载体的丝状真菌宿主细胞。本专利技术还涉及一种用于产生ISP的方法，涉及通过这样的方法可获得的ISP，涉及ISP，涉及包含这种ISP的食物组合物，涉及一种使用所述ISP制备食物组合物的方法，以及涉及所述ISP在食物组合物中的用途。专利技术背景具有潜在许多应用可能性的一组受关注蛋白质是冰结构蛋白质(ISP)，其通常被称为抗冻蛋白质(antifreeze protein，AFP)。Warren等人(US5118792)已经建议在冷冻前将经纯化的ISP直接加入食物产品中以改善冷冻储存期间的保藏特征。WO90/13571A1教导了通过使用分离形式的抗冻多肽抑制冰晶生长或者抑制冰再结晶，来改善食物产品的耐冷冻性的方法。在过去已经提出了ISP在食物和非食物中的大量应用，例如Griffith和Vanya Ewart(1995)Biotechnology Advances 13:375-402和EP2602263A2中所例示的。然而，由于使用ISP的高成本，许多应用当前在经济上是不可行的。使用此类ISP的成本必须尽可能低，以允许开发许多不同的应用。虽然当前使用源自大洋鲶(ocean pout)的AFP III型HPLC12进行工业规模的冰淇淋生产，但是与以经济上有吸引力的价格大量生产ISP相关联的困难阻碍了其在其它工业应用中的使用。可在不同应用中使用的理想ISP将在低浓度时具有高活性，低成本，轻易可得并且使用简单。通过选择每摩尔蛋白质具有高冰结构活性的ISP来获得低成本的ISP使用。最深入研究和工业使用的ISP(源自大洋鲶的III型AFP)用于在-6℃下的30％蔗糖溶液中获得再结晶抑制的最小浓度已经被报告为>700nM(Smallwood等(1999)Biochem.J.340:385-391；Tomczak等(2003)Biochem.Biophys.Res.Comm.311:1041-1046)。因此，在应用中需要相对高的ISP浓度来获得令人满意的结果。联合利华公司(Unilever)已经报导冰淇淋应用中ISP(III型AFP)的浓度为约50mg/kg(w/w)(Lewis(2006)Application for the Approval of Ice Structuring Protein Type III HPLC 12 Preparation for use in Edible Ices,Regulation(EC)No 258/97 of the European Parliament and of the Council of 27th January 1997 Concerning Novel Foods and Novel Food Ingredients)，此等效于7μM的此ISP。还有已经报导的是，可用3-25μM的III型AFP来抑制冰晶生长(Li和Hew(1991)Protein engineering 4:1003-1008)。以更低的所需剂量产生类似效果的ISP将有益地降低这些蛋白质的使用成本并且将开拓开发另外应用的可能性。此外，每kg发酵液中ISP的高度表达将导致降低的成本价格和低使用成本。高度表达还将产生仅需要最少纯化的更纯产品，从而进一步降低成本价格。然而目前在文献中描述的ISP的生产率低。来自大洋鲶的III型AFP在发面酵母Saccharomyces cerevisiae中的表达已经被报导为困难的(US 6914043 B1)并且当培养液的上清液未稀释时仅为可检测到，这暗示了低水平表达。此外，Leucosporidium的ISP(LeIBP)在Escherichia coli或者Pichia pastoris中的表达被描述为在摇瓶中介于2.1和61.2毫克/升培养液之间(Park等(2012)Cryobiology 64:286-296)，虽然这两种微生物过去的记录是成功地以高水平表达异源蛋白。近来Lee等人已经汇总了关于已知ISP的表达的所有文献，并且总结出表达水平不超过175mg/l(Lee等(2013)Appl.Microbiol.Biotechnol.97:3383-3393)。他们提出ISP应用极大地受到经济实惠的生产系统的缺乏的阻碍。相同的作者通过分批补料和在降低的温度下加入甲醇来诱导生产的组合将LeIBP的生产率增大到了约300mg/l。由于发酵中的低生产率，蛋白质必须在其可用于进一步实验之前浓缩和纯化，从而导致了非常不良的产率和最终的高成本价格。此类措施可有助于实验室规模的发酵，但是对于工业生产来说并不经济实惠。由于当前描述的ISP的使用成本高，因此ISP在工业中的使用是有限的。除了使用成本以外，还重要的是终产品具有关于食物产品中ISP应用的GRAS(一般被认为是安全的)状态。在文献中描述的许多ISP是在微生物体中表达或者是使用缺乏此状态的工艺生产的，并且因此不能用于食物应用中。举例来说，LeIBP当前是在Pichia pastoris中表达的，Pichia pastoris是一种需要加入有毒甲醇来诱导LeIBP表达的酵母(Lee等人(2013))。因此，存在对高活性、低成本、可以食品级形式轻易获得并且使用简单的ISP的需要。专利技术概述本专利技术基于来自Leucosporidium sp.的冰结构蛋白质(AFP19)在丝状真菌中的成功表达。AFP19在丝状真菌中的表达水平惊人地、异常地高，比文献中描述的在细菌或者酵母中的表达要高得多。此外，在丝状真菌中表达的AFP19在极低浓度下表现出了非常良好的冰再结晶抑制活性。此ISP表现为在约20nM对冰再结晶具有活性，比所发现的来源于大洋鲶的当前工业标准III型AFP的浓度低35倍。惊人地，AFP19在丝状真菌中的生产率在摇瓶规模下高于1g/l。相同蛋白质在摇瓶规模下于酵母或者细菌中的生产率已经在文献中被报导为低15-500倍(命名为LeIBP)。因此，在丝状真菌中表达的AFP19的使用成本将比所有目前已知的ISP低得多。因此，相较于目前已知的ISP，使用在丝状真菌中表达的AFP19将使很多工业应用成为经济上可行的。此外，看起来在丝状真菌中产生的ISP是稳定的蛋白质：可能的稳定化特性是N-糖基化或者O-糖基化和/或在N末端由焦谷胺酸封闭。根据本专利技术，由此提供了核酸构建体，其包含：编码冰结构蛋白质(ISP)的核酸序列，所述ISP包含SEQ ID NO:1所示的序列或者与其至少80％同一的序列，或者包含SEQ ID NO:1中的第21至261位氨基酸所示的序列或者与其至少80％同一的序列；以及有效地连接至此序列的控制序列，其允许所述核酸序列在丝状真菌宿主细胞中表达。本专利技术还提供了：-表达载体，其包含本专利技术的核酸构建体；-丝状真菌宿主细胞，其包含本专利技术的核酸构建体或者表达载体；-用于产生冰结构蛋白质(ISP)的方法，所述方法包括：-提供丝状真菌宿主细胞，所述丝状真菌宿主细胞包含编码ISP的核酸序列，所述ISP包含S本文档来自技高网...
【技术保护点】
核酸构建体，其包含：编码冰结构蛋白质(ISP)的核酸序列，所述冰结构蛋白质包含在SEQ ID NO:1中示出的序列或者与其至少80％同一的序列，或者包含在SEQ ID NO:1的第21至261位氨基酸中示出的序列或者与其至少80％同一的序列；以及有效连接至所述核酸序列的控制序列，所述控制序列允许所述核酸序列在丝状真菌宿主细胞中表达。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.02 EP 13195351.51.核酸构建体，其包含：编码冰结构蛋白质(ISP)的核酸序列，所述冰结构蛋白质包含在SEQ ID NO:1中示出的序列或者与其至少80％同一的序列，或者包含在SEQ ID NO:1的第21至261位氨基酸中示出的序列或者与其至少80％同一的序列；以及有效连接至所述核酸序列的控制序列，所述控制序列允许所述核酸序列在丝状真菌宿主细胞中表达。2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述核酸序列编码ISP，所述ISP包含在SEQ ID NO:1中示出的序列或者与其至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％同一的序列，或者包含在SEQ ID NO:1的第21至261位氨基酸中示出的所述序列或者与其至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％同一的序列。3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体，其中所述核酸编码ISP，所述ISP具有能够从Leucosporidium属的北极酵母中获得的氨基酸序列。4.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中所述控制序列包含不与编码ISP的核酸天然相关联的启动子。5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸是经密码子对优化以用于在所述丝状真菌宿主细胞中表达的。6.包含根据权利要求1到权利要求5中任一项所述的核酸构建体的表达载体。7.丝状真菌宿主细胞，其包含根据权利要求1到权利要求5中任一项所述的核酸构建体或者根据权利要求6所述的表达载体。8.根据权利要求7所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞是Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Rasamsonia、Thielavia、Fusarium或Trichoderma属的。9.根据权利要求7或8所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞是Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Fusarium venenatum和Trichoderma reesei。10...
【专利技术属性】
技术研发人员：芮妮·马赛尔·钟·德，彼得吕斯·雅各布斯·西奥多瑞斯·蒂克尔，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL
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