本发明专利技术涉及一种重组细胞筛选系统及其构建方法，所述重组细胞筛选系统包括：可组成型表达非核糖体肽合成酶编码基因的受体细胞和含有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因的质粒。本发明专利技术的系统无需添加外源底物，也无需特殊的检测设备，能够快速、简便、经济、高效地完成筛选过程。本发明专利技术在实施例中也具体阐述了该系统的应用实例-基因片段的克隆筛选，证明了本发明专利技术的系统可有效用于重组细胞的筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组细胞筛选
，具体来说，涉及一种重组细胞筛选系统及其 构建方法。
技术介绍
基于报告基因的筛选系统是分子生物学研究中的重要工具，在基因表达、蛋白质 互作及药物筛选等研究中发挥着重要的作用。目前已经应用的筛选系统主要基于如下蛋白 或酶的编码基因：0 _半乳糖苷酶（0 -Lactamase)、0 -葡萄糖苷酶（0 -glucuronidase)， 焚光素酶（luciferase)和各种焚光蛋白（fluorescent protein)等。 但是这些筛选系统存在一定的不足之处，它们或需要额外添加前体底物，或需要 特别的硬件检测设备。比如半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶，荧光素酶分别需要提供 X-gal，X-gluc和luciferin作为信号产生的底物，实际操作过程中往往由于底物添加不均 匀或者底物不能正常进入细胞内部从而极大地影响了筛选效果，另外这些前体底物的价格 一般较高。基于荧光素酶的筛选系统需要光子检测设备，基于荧光蛋白的筛选系统需要特 定波长的激发光源产生设备。总之，前体底物和硬件设备的需求不但增加了筛选系统的复 杂性和筛选的假阳性，而且增加了筛选的经济成本。
技术实现思路
本专利技术提供了一种重组细胞筛选系统及其制备方法，使用该系统时无需添加前体 底物，避免了底物添加不均匀或不能正常进入细胞内部产生的问题，该系统产生的蓝色色 素在可见光下用肉眼观察就可获得直观的结果，使用方便且降低了筛选成本。 本专利技术的一个方面，提供一种重组细胞筛选系统，包括：可组成型表达非核糖体肽 合成酶编码基因的受体细胞和含有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因的质粒。 以上所述的重组细胞筛选系统中，所述磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因的第五 个密码子之后插入了多克隆位点。 以上所述的重组细胞筛选系统中，所述非核糖体肽合成酶编码基因的序列如SEQ ID N0 :1 所示。 以上所述的重组细胞筛选系统中，所述非核糖体肽合成酶编码基因的启动子序列 如 SEQ ID N0 :2 所示。 以上所述的重组细胞筛选系统中，所述非核糖体肽合成酶编码基因的核糖体结合 位点序列如SEQ ID N0 :3所示。 以上所述的重组细胞筛选系统中，所述受体细胞为原核细胞、真菌细胞或哺乳动 物细胞；具体地，所述受体细胞为大肠杆菌；更具体地，所述大肠杆菌为E. coli JM109。 本专利技术的另一个方面，提供一种以上所述的重组细胞筛选系统的构建方法，包括 如下步骤： (1)将含有非核糖体肽合成酶编码基因及其启动子和其核糖体结合位点的DNA序 列整合到受体细胞基因组中； (2)构建含有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因的质粒。 以上所述的构建方法，所述非核糖体肽合成酶编码基因的序列如SEQIDN0 :1所 示，所述非核糖体肽合成酶编码基因的启动子序列如SEQIDN0 :2所示，所述非核糖体肽合 成酶编码基因的核糖体结合位点序列如SEQIDN0 :3所示。 以上所述的构建方法，所述受体细胞为原核细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞；具体 地，所述受体细胞为大肠杆菌；更具体地，所述大肠杆菌为E. coli JM109。 以上所述的构建方法，其中步骤（2)中所述磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因替 代质粒PUC19中的lacZ a基因，并将所述磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因的第五个密码 子之后插入了多克隆位点；具体地，所述多克隆位点来自PUC19;更具体地，所述磷酸泛酰 巯基乙胺转移酶编码基因来源于枯草芽孢杆菌。 以上所述的构建方法，所述含有非核糖体肽合成酶编码基因及其启动子和其核糖 体结合位点的DNA序列通过大肠杆菌整合型质粒p0SIP-K0为载体整合到E. coli JM109的 基因组上，再去除P0SIP-K0来源的整合元件和抗性基因元件仅保留非核糖体肽合成酶表 达元件。 本专利技术系统的构建是基于链霉菌来源的非核糖体肽合成酶编码基因idgS和芽孢 杆菌来源的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因sfp。活性的IdgS(Holo-idgS)能够催化 L-谷氨酰胺（L-Gln)生成蓝色化合物-蓝靛素（indigoidine)，而idgS的直接表达产物 (Apo-IdgS)没有活性，需经翻译后修饰过程（该过程由磷酸泛酰巯基乙胺转移酶催化）才 能变成活性形式，Sfp蛋白能够完成IdgS的活化。L-谷氨酰胺（L-Gln)存在于所有细胞 内，无需外源添加，因此只要活性的IdgS纯在于细胞内，该细胞就会以内源L-谷氨酰胺为 底物合成蓝色化合物-蓝靛素（indigoidine)，因而呈现出肉眼可见的蓝色。 另外本专利技术在sfp基因的第五个密码子后同框插入多克隆位点区，并不影响sfp 的功能，并且带有多克隆位点区的sfp为该系统的使用提供了便利。 与传统的筛选系统相比，本专利技术的系统无需添加外源底物，也无需特殊的检测设 备，能够快速、简便、经济、高效地完成筛选过程。本专利技术在实施例中也具体阐述了该系统的 应用实例-基因片段的克隆筛选，证明了本专利技术的系统可有效用于重组细胞的筛选。【附图说明】 图1为本专利技术的重组细胞筛选系统构建原理示意图。 图2为本专利技术实施例提供的工程菌株idgSOl和idgS02构建过程示意图。 图3为本专利技术实施例提供的E. coli idgsOl的验证结果电泳图；其中，泳道（1、2、 3)和泳道（4、5、6)分别对应三个随机挑选的转化子。 图4质粒pSFPHE及多克隆位点示意图。 图5含有质粒pSFPHE的菌株E. coli idgS02呈现蓝色表型。 图6为本专利技术实施例中GFP基因克隆筛选在可见光下的蓝白斑表型。图7为本专利技术实施例中GFP基因克隆筛选在紫外灯下的表型，结果显示白色菌落 与GFP基因的成功插入存在良好的对应关系。【具体实施方式】 以下结合附图和实施例，对本专利技术的【具体实施方式】进行更加详细的说明，以便能 够更好地理解本专利技术的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的【具体实施方式】和实 施例仅是说明的目的，而不是对本专利技术的限制。本专利技术仅以大肠杆菌为例，但是该系统在真 菌细胞及哺乳动物细胞中也有极大的应用潜力。 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 实施例1、idgS密码子的优化与全基因合成 idgS 基因（具体序列见 SEQ ID N0 :6)是本实验室从 Streptomyces lavendulae CGMCC No. 4. 1386克隆到的一个非核糖体肽合成酶编码基因。为了使该基因能够在大肠杆 菌中得到更好的表达，根据大肠杆菌的密码子使用偏好，重新设计了 idgS基因序列（命名 为idgSE。，具体序列见SEQ ID N0:1)。同时在idgS-E.rall上游，一并设计了一个强启动子 (T5pr 〇m〇ter，具体序列见SEQ ID N0:2)和一个强核糖体结合位点（RBSs，具体序列见SEQ ID N0 :3)。包含有强启动子和强核糖体结合位点的idgSE。命名为T5p-Rs-idgSE。，并委托由 DNA合成公司（北京擎科新业生物技术有限公司）进行全基因合成，全序列见SEQ ID N0: 4〇 实施例2、构建工程菌株E. coli idgSOl 如本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组细胞筛选系统，其特征在于，包括：可组成型表达非核糖体肽合成酶编码基因的受体细胞和含有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因的质粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈义华，谢周杰，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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