【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
,涉及一种稳定高效表达重组人透明质酸酶的CHO-K1SP细胞株。
技术介绍
透明质酸(HA)主要发现于哺乳动物的结缔组织、皮肤、软骨中以及滑液中。透明质酸也是眼睛玻璃体的主要组成成分。在结缔组织中,与透明质酸相关的水合作用的水产生了组织之间的空间,从而为细胞运动和增殖创造了有利的环境。透明质酸在与细胞运动有关的生物学现象中发挥关键作用,这些细胞运动包括快速发育(rapiddevelopment)、再生、修复、胚胎发生、胚胎发育、伤口愈合、血管生成和肿瘤发生。透明质酸酶是一类特异性水解透明质酸的水解酶,广泛存在于真核生物和原核生物中,主要水解透明质酸,是一种重要的生理活性物质。在动物机体内参与许多重要的生物学过程,例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复,以及正常细胞和肿瘤细胞增生。许多病理变化过程往往伴随着透明质酸酶和透明质酸的变化,暗示它们可能起着重要的作用。同时透明质酸酶也可以改变机体内一些药物和生理活性物质的分布状况。透明质酸酶有三大类:1.哺乳动物类型透明质酸酶(EC3.2.1.35),其是内-N-乙酰氨基己糖苷酶,以四糖和己糖作为主要的终产物。它们具有水解和转糖苷酶活性,能够降解透明质酸和硫酸软骨素(CS),尤其是C4-S和C6-S。2.细菌透明质酸酶(EC4.2.99.1)降解透明质酸,并不同程度地降解CS和DS。它们是内-P-N-乙酰氨基己糖苷酶,它们通过P消去反应发挥作用,主要产生二糖终产物。3.来自水蛭、其它寄生虫和甲壳类动物的透明质酸酶(EC3.2.1.36),其 ...
【技术保护点】
一种CHO‑K1SP细胞株,其特征在于,能高效表达重组人透明质酸酶。
【技术特征摘要】
1.一种CHO-K1SP细胞株,其特征在于,能高效表达重组人透明质酸酶。2.如权利要求1所述的CHO-K1SP细胞株的构建方法,其特征在于,包括以下几个步骤:步骤A:人工合成如SEQIDN0.1所示的核苷酸序列,插入到pGenHT1.0载体的多克隆位点,得到重组质粒;步骤B:将质粒转入无血清悬浮驯化的CHO-K1SP的中;步骤C:在CD-CHO+msx筛选培养基中进行加压筛选,得到混合克隆细胞;步骤D:挑选单克隆细胞株,筛选得到高效表达的重组人透明质酸酶的CHO细胞株。3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤A包括以下几个步骤:步骤A1:rHuPH20基因的获得:查询UniProtKB数据库中人透明质酸酶(rHuPH20)的基因的序列,选取rHuPH20胞外的区域,氨基酸序列如SEQIDN0.1所示,对其核酸序列进行密码子优化,再进行全基因合成并连接到puc57载体上,构建puc57/rHuPH20重组质粒;步骤A2:pGenHT1.0/rHuPH20重组质粒的获得:基于同源重组的方法构建载体,利用puc57/rHuPH20重组质粒PCR扩增rHuPH20片段,用HindIII和ECORI双酶切将pGenHT1.0在无菌EP管中加入rHuPH20的PCR产物,以及经HindIII和ECORI双酶切的pGenHT1.0载体片段,T4DNA聚合酶和T4缓冲液,反应后,将反应产物转化感受态大肠杆菌DH5ɑ于LB(Amp+)平板涂布培养,筛选阳性克隆转接到LB(Amp+)培养液中,过夜培养后利用小量快速提取试剂盒进行质粒提取,进行PCR鉴定;步骤A3:重组质粒的制备:采用提取pGenHT1.0/rHuPH20重组质粒,经离心后,透析、沉淀、干燥和溶解后,保存备用。4.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤D包括以下几个步骤:步骤D1:稳定转染:将CHO-K1SP细胞转染前按常规传代,接种后,转染,再将转染试剂和pGenHT1.0/rHuPH20重组质粒DNA加入到OptiCHOSFM无血清培养基中,柔混匀,孵育,再将得到的质粒-转染试剂混合液缓慢且均匀的滴入到细胞培养瓶中,振荡培养;转染后,将细胞传代至细胞培养皿中,再继续传代后换成含筛选培养基进行筛选,待细胞活力和密度恢复后,对混合克隆细胞进行了克隆化,以获得高表达的单克隆细胞株;步骤D2:挑选单克隆:通过对悬浮细胞进行计数,将细胞进行一系列的稀释铺孔板上,再进行培养,取培养上清进行检测选取单克隆孔细胞,继续扩大培养,待细胞密度合适时冻存细胞。5.如权利要求2所述的方法,其特征在于,rHuPH20氨基酸序列为:MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQF...
【专利技术属性】
技术研发人员:李润明,
申请(专利权)人:广州白云山拜迪生物医药有限公司,
类型:发明
国别省市:广东;44
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