食管癌顺铂耐药性细胞株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及食管癌顺铂耐药性细胞株及其构建方法和应用。本发明专利技术以食管癌细胞为诱导对象，采用从0.02-0.04μg/ml、0.05-0.07μg/ml、0.12-0.13μg/ml、0.2-0.3μg/ml和0.4-0.6μg/ml 5个浓度梯度连续处理处于对数生长期的食管癌细胞，培养5-7个月，得在作用浓度为0.4-0.6μg/ml顺铂的培养体系中稳定生长、传代的细胞株。本发明专利技术构建得到的食管癌顺铂耐药细胞株的耐药倍数在11倍以上，为研究食管癌耐药机制、寻找克服食管癌耐药的有效治疗方法及指导临床用药提供了耐药细胞模型，具有良好的应用前景。

Esophageal cancer cisplatin resistant cell strain and construction method and application thereof

The invention belongs to the technical field of biomedicine, in particular to a cisplatin resistant cell line of esophageal cancer, a construction method and an application thereof. The present invention in esophageal carcinoma cells induced by 0.02-0.04, g/ml, 0.05-0.07 from g/ml, 0.12-0.13 g/ml, 0.2-0.3 g/ml and 0.4-0.6 g/ml 5 concentration gradient for continuous treatment of esophageal cancer cells in the logarithmic growth phase, training for 5-7 months, have stable growth, the concentration of passage in culture system for 0.4-0.6 g/ml of cisplatin in cell lines. The invention constructs a cisplatin resistant human esophageal carcinoma cell line to obtain the resistance ratio of more than 11 times, overcome the effective method for the treatment of esophageal cancer drug resistance and to guide the clinical treatment for esophageal cancer drug resistance mechanism, provides a resistant cell model, it has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，具体涉及食管癌顺铂耐药性细胞株及其构建方法和应用。
技术介绍
食管癌是一种常见的食道恶性肿瘤，其中食管腺癌和食管鳞癌是最常见的食管癌，食管腺癌主要发生在食管下部和食管与胃连接的部位，而食管鳞癌主要发生于食管的上部和食管的中部。我国的食管癌患者大多为食管鳞状细胞癌（Esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC），占了食管癌患者的90%以上，而在西方国家，食管腺癌的发病率较高。无论是食管腺癌还是食管鳞癌，其早期一般无发病症状，直到晚期病症才会凸显，因此，人们很容易忽略早期食管腺癌和食管鳞癌的存在，待发现时已经错过了治疗食管癌的最佳时机。临床上用于治疗食管癌的主要方式有：手术治疗、化疗治疗、放疗治疗和药物治疗。手术切除后辅助化学疗法是早期食管癌患者的主要治疗方式，但是上述方法对末期食管癌患者治疗效果不理想，而且副作用大。目前，临床上主要采用药物治疗食管癌，主要治疗食管癌的药物有：顺铂、五氟尿嘧啶、紫杉醇等，但是上述药物在治疗食管癌的过程中存在选择性差，易出现耐药性的缺点。因此，研究食管癌耐药机制并且有效预防或逆转食管癌耐药现象是目前亟需解决的难题。近年来，肿瘤耐药细胞株已成为肿瘤细胞耐药机制研究、开发新型抗肿瘤药物及评价新的肿瘤治疗方法的重要工具。目前，国内外已经建立了很多肿瘤的耐药细胞株。中国专利申请201410161660.8公开了一种肝细胞癌索拉菲尼耐药细胞株及其构建方法，中国专利申请201410183516.4公开了一种表柔比星诱导建立的乳腺癌多药耐药性细胞株及其构建方法和应用，中国专利申请201510187748.1公开了曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株及其制备方法和应用。但目前尚无食管癌对顺铂的耐药细胞株。因此，建立食管癌对顺铂的耐药细胞株具有重要的临床价值。
技术实现思路
为了解决现有技术中的不足，本专利技术的目的之一在于提供食管癌顺铂耐药性的细胞株。本专利技术提供了食管癌顺铂耐药性细胞株，通过以下步骤构建得到：S1将食管癌细胞株放置在36-38℃、4-6%CO2、湿度为95-98%条件下的培养箱中培养；S2将对数生长期的食管癌细胞培养至70-80%贴壁率时，弃去上清，加入含顺铂的培养液，所述顺铂的作用浓度为0.02-0.04μg/ml，培养1-2小时后弃去含药培养液，加入1-2ml胰蛋白酶-EDTA消化液，接着以l×105/ml细胞浓度接种于新培养瓶中，在36-38℃、4-6%CO2、湿度为95-98%的条件下培养，待细胞长至70-80%贴壁率时再次加入顺铂处理，24小时后换新鲜的培养液，维持顺铂的作用浓度不变，培养6-8周后，得稳定生长、传代的细胞株；S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺铂的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增加一次顺铂的作用浓度培养4-5周，培养5-7个月，得在作用浓度为0.4-0.6μg/ml顺铂的培养体系中稳定生长、传代的细胞株，即得。进一步地，所述的食管癌顺铂耐药性细胞株通过以下步骤构建得到：S1将食管癌细胞株放置在37℃、5%CO2、湿度为96%条件下的培养箱中培养；S2将对数生长期的食管癌细胞培养至75%贴壁率时，弃去上清，加入含顺铂的培养液，所述顺铂的作用浓度为0.03μg/ml，培养1小时后弃去含药培养液，加入1.5ml胰蛋白酶-EDTA消化液，接着以l×105/ml细胞浓度接种于新培养瓶中，在37℃、5%CO2、湿度为96%的条件下培养，待细胞长至75%贴壁率时再次加入顺铂处理，24小时后换新鲜的培养液，维持顺铂的作用浓度不变，培养8周后，得稳定生长、传代的细胞株；S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺铂的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增加一次顺铂的作用浓度培养5周，培养7个月，得在作用浓度为0.5μg/ml顺铂的培养体系中稳定生长、传代的细胞株，即得。进一步地，所述步骤S1的食管癌细胞为食管癌细胞Eca-109和食管癌细胞EC-9706；所述食管癌细胞Eca-109的培养液为含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液；所述食管癌细胞EC-9706的培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液。进一步地，所述步骤S3中适当增加顺铂的作用浓度是采用0.02-0.04μg/ml、0.05-0.07μg/ml、0.12-0.13μg/ml、0.2-0.3μg/ml和0.4-0.6μg/ml5个浓度梯度，优选地，所述步骤S3中适当增加顺铂的作用浓度是采用0.03μg/ml、0.06μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml和0.5μg/ml5个浓度梯度。进一步地，所述食管癌细胞Eca-109细胞株对顺铂的耐药倍数为11.46倍；所述食管癌细胞EC-9706细胞株对顺铂的耐药倍数为11.15倍。另外，本专利技术的目的之二在于提供一种食管癌顺铂耐药性细胞株的构建方法，包括以下步骤：S1将食管癌细胞株放置在36-38℃、4-6%CO2、湿度为95-98%条件下的培养箱中培养；S2将对数生长期的食管癌细胞培养至70-80%贴壁率时，弃去上清，加入含顺铂的培养液，所述顺铂的作用浓度为0.02-0.04μg/ml，培养1-2小时后弃去含药培养液，加入1-2ml胰蛋白酶-EDTA消化液，接着以l×105/ml细胞浓度接种于新培养瓶中，在36-38℃、4-6%CO2、湿度为95-98%的条件下培养，待细胞长至70-80%贴壁率时再次加入顺铂处理，24小时后换新鲜的培养液，维持顺铂的作用浓度不变，培养6-8周后，得稳定生长、传代的细胞株；S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺铂的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增加一次顺铂的作用浓度培养4-5周，培养5-7个月，得在作用浓度为0.4-0.6μg/ml顺铂的培养体系中稳定生长、传代的细胞株，即得。进一步地，所述步骤S1的食管癌细胞为食管癌细胞Eca-109和食管癌细胞EC-9706；所述食管癌细胞Eca-109的培养液为含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液；所述食管癌细胞EC-9706的培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液。进一步地，所述步骤S3中适当增加顺铂的作用浓度是采用0.02-0.04μg/ml、0.05-0.07μg/ml、0.12-0.13μg/ml、0.2-0.3μg/ml和0.4-0.6μg/ml5个浓度梯度。此外，本专利技术的目的之三在于提供食管癌顺铂耐药性细胞株在筛选逆转肿瘤耐药性药物中的应用。本专利技术的目的之本文档来自技高网...

【技术保护点】
食管癌顺铂耐药性细胞株，其特征在于，通过以下步骤构建得到：S1将食管癌细胞株放置在36‑38℃、4‑6%CO2、湿度为95‑98%条件下的培养箱中培养；S2将对数生长期的食管癌细胞培养至70‑80%贴壁率时，弃去上清，加入含顺铂的培养液，所述顺铂的作用浓度为0.02‑0.04μg/ml，培养1‑2小时后弃去含药培养液，加入1‑2 ml胰蛋白酶‑EDTA消化液，接着以l×105/ml细胞浓度接种于新培养瓶中，在36‑38℃、4‑6%CO2、湿度为95‑98%的条件下培养，待细胞长至70‑80%贴壁率时再次加入顺铂处理，24小时后换新鲜的培养液，维持顺铂的作用浓度不变，培养6‑8周后，得稳定生长、传代的细胞株；S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺铂的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增加一次顺铂的作用浓度培养4‑5周，培养5‑7个月，得在作用浓度为0.4‑0.6μg/ml顺铂的培养体系中稳定生长、传代的细胞株，即得。

【技术特征摘要】
1.食管癌顺铂耐药性细胞株，其特征在于，通过以下步骤构建得到：
S1将食管癌细胞株放置在36-38℃、4-6%CO2、湿度为95-98%条件下的培养箱中培养；
S2将对数生长期的食管癌细胞培养至70-80%贴壁率时，弃去上清，加入含顺铂的培养
液，所述顺铂的作用浓度为0.02-0.04μg/ml，培养1-2小时后弃去含药培养液，加入1-2ml
胰蛋白酶-EDTA消化液，接着以l×105/ml细胞浓度接种于新培养瓶中，在36-38℃、4-6%CO2、
湿度为95-98%的条件下培养，待细胞长至70-80%贴壁率时再次加入顺铂处理，24小时后换
新鲜的培养液，维持顺铂的作用浓度不变，培养6-8周后，得稳定生长、传代的细胞株；
S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺铂的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增
加一次顺铂的作用浓度培养4-5周，培养5-7个月，得在作用浓度为0.4-0.6μg/ml顺铂的培
养体系中稳定生长、传代的细胞株，即得。
2.如权利要求1所述的食管癌顺铂耐药性细胞株，其特征在于，通过以下步骤构建得
到：
S1将食管癌细胞株放置在37℃、5%CO2、湿度为96%条件下的培养箱中培养；
S2将对数生长期的食管癌细胞培养至75%贴壁率时，弃去上清，加入含顺铂的培养液，
所述顺铂的作用浓度为0.03μg/ml，培养1小时后弃去含药培养液，加入1.5ml胰蛋白酶-
EDTA消化液，接着以l×105/ml细胞浓度接种于新培养瓶中，在37℃、5%CO2、湿度为96%的条
件下培养，待细胞长至75%贴壁率时再次加入顺铂处理，24小时后换新鲜的培养液，维持顺
铂的作用浓度不变，培养8周后，得稳定生长、传代的细胞株；
S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺铂的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增
加一次顺铂的作用浓度培养5周，培养7个月，得在作用浓度为0.5μg/ml顺铂的培养体系中
稳定生长、传代的细胞株，即得。
3.如权利要求1或2所述的食管癌顺铂耐药性细胞株，其特征在于，所述步骤S1的食管
癌细胞为食管癌细胞Eca-109或食管癌细胞EC-9706；所述食管癌细胞Eca-109的培养液为
含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液；所述食管癌细胞EC-9706的培养液为含10%胎牛血清的
DMEM培养液。
4.如权利要求1所述的食管癌顺铂耐药性细胞株，其特征在于，所述步骤S3中适当增加

【专利技术属性】
技术研发人员：王绍祥，王晓，王一飞，钟雪云，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44