基于碱基编辑靶向CD133的CAR-T细胞制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于碱基编辑制备PD‑1基因敲除且靶向CD133的CAR‑T细胞制备方法及应用。通过BE‑Plus系统进行基因敲除的同时将表达白细胞分化抗原CD133‑CAR的质粒载体导入T细胞的制备方法，所得CAR‑T细胞可应用于制备抗肿瘤药物。本发明专利技术公开的PD‑1基因敲除且靶向CD133的CAR‑T细胞制备工艺简单，在肿瘤的细胞治疗中拥有较高的应用价值。

Preparation and application of CAR-T cells targeting CD133 based on base editing

The invention discloses a preparation method and application of CAR T cells for preparing PD_1 gene knockout and targeting CD133 based on base editing. The plasmid vector expressing leucocyte differentiation antigen CD133 CAR was introduced into T cells by BE Plus system. The obtained CAR T cells can be used to prepare anti-cancer drugs. The invention discloses a simple preparation process of CAR T cells with PD 1 gene knockout and targeting CD133, and has high application value in the cell therapy of tumors.

【技术实现步骤摘要】
基于碱基编辑靶向CD133的CAR-T细胞制备方法及应用
本专利技术涉及免疫学领域，具体涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种敲除PD-1基因且表达CD133-CAR的T细胞的制备方法及其应用。
技术介绍
CD133是一种细胞表面抗原标志，属prominin家族成员之一，也被称为prominin-1，在人类中是由PROM1基因编码的糖蛋白。其属于跨膜蛋白的一员，特异定位于细胞突起。当嵌入细胞膜时，在细胞膜中prominin-1的膜拓扑结构使N端延伸到胞外空间，C端位于胞内腔室。CD133在造血干细胞、内皮祖细胞、胶质母细胞瘤、神经元和胶质干细胞、各种小儿脑肿瘤、以及成人肾、乳腺、气管、唾液腺、子宫、胎盘、消化道、睾丸等细胞类型中表达。其分子结构较为独特，同时表达呈组织依赖性。有文献报道，CD133阳性细胞和肿瘤发生、转移、侵袭、耐药及复发均关系密切。CD133最初被描述为人类造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的表面抗原，是最常用的肿瘤干细胞(CSC)分离的标记物，主要来自各种胶质瘤和癌细胞。另外CD133作为混合系白血病MLL-AF4的关键靶点，并在发生MLL重排的B-ALL中均有表达。在CD133和消化系肿瘤的相关报道中，国内对胃癌组织采用RT-PCR技术测得CD133在癌旁和原发组织间的差异具有统计学意义，提示CD133和胃癌产生密切相关。CAR-T是一种通过把患者自己的防御细胞（T细胞）取出来，人工（依靠基因技术）加上一种能够识别癌症细胞的部件（癌细胞识别抗原受体），并大量复制，再给回患者，从而激发患者自身防御细胞的杀伤功能杀死癌症细胞。嵌合抗原受体（CAR）是CAR-T的核心部件，使得免疫细胞HLA具有非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力。CAR分子的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区（SinglechainantibodyFragment，ScFv），一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号转导区。其中scFv段的设计对于CAR的特异性、有效性以及基因改造免疫细胞自身的安全性是关键的决定因素。将患者T细胞制作成CAR-T细胞，然后经过体外扩增后，回输到患者体内进行抗肿瘤治疗，与传统肿瘤治疗方法相比，该方法为细胞靶向性治疗，副作用小，而且经过基因修饰的T细胞可在其表面稳定的表达抗原结合域，识别靶抗原的同时，无MHC限制性，提高了肿瘤的治疗效果。已有报道表明CD133特异性的CAR-T细胞或NK细胞，可杀死来源于病患的神经胶质瘤干细胞或卵巢癌干细胞。在一个晚期胆管癌患者中，CD133特异性CAR-T细胞治疗获得了持续4.5个月的部分响应。在实体瘤的免疫治疗方面，CAR-T细胞的活性易受多种因素影响，比如缺乏肿瘤特异性抗原，或者难以到达肿瘤部位，以及易受肿瘤微环境影响丧失功能或活性。肿瘤微环境的免疫逃逸机制主要是通过PD-1/PD-L1抑制通路，导致T细胞不能杀伤肿瘤细胞。通过靶向敲除PD-1基因，可以解除PD-1/PD-L1的抑制通路，有助于改良靶向CD133的CAR-T细胞的功效。此外，将CAR-T细胞进行PD-1基因敲除，使其免受肿瘤微环境的抑制，可能提高靶向杀伤能力。中国专利201710793243.9已公开了一种PD-1基因沉默的靶向CD133的CART细胞及制备方法，其是通过将CRISPR-Cas9和PiggyBac转座子系统同时导入PBMC中敲除靶向CD133的CART细胞中的PD-1基因而获得，其结果显示PD-1基因敲除且靶向CD133的CAR-T细胞对U251CD133-OE靶细胞在不同效靶比条件下杀伤效率均高于未敲除组。但是，CRISPR-Cas9介导的基因编辑存在严重的脱靶效应，使其在临床应用上存在一定的安全隐患。现有免疫药物制备过程复杂，成本昂贵，因此本领域技术人员致力于开发能够简化、优化制备过程、降低制备成本的技术方案。本专利技术提供了一种具有更高效率制备目的免疫细胞的技术方案。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞，该T细胞能够免受肿瘤微环境的抑制，特别是PD-1通路介导的免疫抑制，且具有超越一般靶向CD133的CAR-T细胞的杀伤能力。本专利技术要解决的技术问题之二是提供一种PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞的制备方法，该方案基于碱基编辑技术，制备工艺简单、编辑效率高。本专利技术要解决的技术问题之三是提供PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。为解决以上问题，本专利技术采用如下技术方案：为了提高基因编辑效率以实现在体基因编辑，本专利技术采用基于CRISPR/Cas9技术的碱基编辑器（baseeditor,BE）。BE-PlUS系统优势在于：第一，与CRISPR-Cas9相比，BE-PLUS具有更高的编辑效率，较低的插入突变率以及更低的脱靶率；第二，与Cas9核酸酶介导的基因编辑相比，BEs可以高效修改点突变基因，是在体基因编辑的良好工具。BE-Plus双质粒系统（ScFv-APOBEC-UGI,GCN4-D10A），在D10A的N端接10个GCN4，APOBECN端接一个scFv。这样GCN4-D10A可以招募10个scFv-APOBEC，使突变的机率增大。Workwindow由4-8扩为4-16，使得效率更高。BE-Plus双质粒系统基本原理为：BEPlus系统携带大鼠胞嘧啶脱氨酶APOBEC1的Cas9，可将胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），尿嘧啶DNA糖基酶抑制剂UDI抑制碱基切除修复机制，使UG配对得以保留，并在后续复制过程中，U替换成T，突变产物理论上可达50%。再通过dCas9和MMR机制，以UG中的U为模板，将UG替换修复成UA，后续复制变为TA，产率在15%~75%之间。使用的基因敲除方法为Istop，在基因编码区内，将正常氨基酸密码子突变为终止密码子，使翻译过程提前终止。对CAR-T细胞进行PD-1基因的定点突变，使其免受肿瘤微环境的抑制，可能提高靶向杀伤能力。本专利技术采用来源于鳞翅目昆虫的PiggyBac转座子，在哺乳动物宿主中活性较高，而且携带片段较大。另外，采用的质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，操作简单而且整合效率相对较高。在本专利技术的第一方面，提供PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞。作为本专利技术优选的技术方案，所述PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞，采用的基因敲除方法是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。作为本专利技术优选的技术方案，所述的基因敲除方法是通过BE-Plus系统来实现，BE-Plus系统中PD1-sgRNA寡核苷酸的设计和构建，具体步骤为：①明确待PD-1基因的编码区（CDs）20bp-NGG目标序列（PAM序列），使其包含完整的目标密码子CAA、CAG、CGA；②目标单碱基C位于目标序列的（左端）第1-16位，效率不一样，优选为第4-16位；并且目标密码子的上游紧邻碱基最好不能为G；③目标单碱基T位于目标序列的（左端）第1-16位，效率不一样，优选为第4-16位；并且目标密码子的上游紧邻碱基最好不能为G；④按照选定的特异性靶序列，分别合成正向具有5’-N20-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PD‑1基因被敲除的CAR‑T细胞，其特征在于，PD‑1基因敲除且表达CD133‑CAR的T细胞，采用的基因敲除方法是通过BE‑Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。

【技术特征摘要】
1.一种PD-1基因被敲除的CAR-T细胞，其特征在于，PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞，采用的基因敲除方法是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。2.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的基因敲除通过BE-Plus系统来实现，具体为：选定基因敲除的位点，设计靶点序列sgRNA，随后筛选出靶点序列，具体如下所示：sgRNA1-F：如SEQIDNO.3所示；sgRNA1-R：如SEQIDNO.4所示；sgRNA2-F：如SEQIDNO.5所示；sgRNA2-R：如SEQIDNO.6所示；sgRNA3-F：如SEQIDNO.7所示；sgRNA3-R：如SEQIDNO.8所示；所示靶点序列可用于质粒载体上，慢病毒载体上，或用于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其他类型载体上。3.如权利要求2所示的CAR-T细胞，其特征在于，所述选出的靶点序列为如下序列：sgRNA1-F：如SEQIDNO.3所示；sgRNA1-R：如SEQIDNO.4所示。4.如权利要求1-3任一项所述的CD133-CAR包含CD133-scFv，CD133-scFv用于识别CD133抗原，该CD133-scFv序列如SEQIDNO.1所示。5.如权利要求4所述的PD-1基因被敲除的表达CD133-CAR的T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）从供者提供的外周血中分离PBMC；（2）在转染体系中，将表达CD133-CAR质粒、转座酶质粒、BEPlus双质粒、靶向PD-1的sgRNA质粒共同转染步骤（1）PBMC细胞，获得转染后的细胞，并进行体外培养、大量扩增；（3）用CD3抗体刺激步骤（2）得到的细胞，以获得PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞，并对所获得T细胞进行后续检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚小云，蒋海娟，刘慧莹，马少文，沈慧，张锋，赵丹，
申请(专利权)人：苏州茂行生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32