本发明专利技术公开了一种重组人MEN1小基因及其无义突变体稳定细胞株，具体为一种含有重组人MEN1小基因和四种含有重组人MEN1小基因无义突变体的稳定细胞株的建立方法以及依照该方法建立的含有重组人MEN1小基因和其无义突变体的五种稳定细胞株。该稳定细胞株的建立方法是将人MEN1小基因和其无义突变体(M1、M2、M3、M4)分别导入HeLa细胞中，经G418筛选，得到稳定细胞株。依照该方法建立的重组人MEN1小基因及其四种无义突变体稳定细胞株分别命名为HMEN1‑WT、HMEN1‑M1、HMEN1‑M2、HMEN1‑M3和HMEN1‑M4。HMEN1‑WT基因组整合MEN1小基因；HMEN1‑M1、‑M2、‑M3、‑M4基因组分别整合无义突变体M1、M2、M3、M4。本发明专利技术建立的上述稳定细胞株，可用于无义突变导致肿瘤的治疗药物的筛选等。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及细胞工程和基因工程技术，具体涉及一种重组人MEN1小基因及其无义突变体稳定细胞株的建立方法和依照该方法建立的重组人MEN1小基因及其无义突变体稳定细胞株。
技术介绍
：基因的无义突变在细胞内产生了含有提前终止密码子(prematuretranslationterminationcodon，PTC)的异常mRNA。这些含有PTC的mRNA在第一轮翻译过程中被细胞内的无义突变介导的mRNA降解途径(nonsense-mediatedmRNAdecay，NMD)所识别和降解，从而消除这种mRNA翻译产生的截短的、有毒的蛋白质对机体的危害。NMD途径是一种重要的真核生物基因转录后监督机制，是基因表达的翻译调控。研究发现，许多癌症和肿瘤的致病原因是由于无义突变导致抑癌基因表达水平严重降低或缺失。因此，抑癌基因无义突变及其翻译调控的研究，有助于揭示基因突变引发癌症的发病机制。多发性内分泌腺瘤I型(multipleendocrineneoplasiatype1，MEN1)是一种常染色体显性遗传紊乱性疾病，以甲状旁腺、胰岛细胞和垂体前叶三种内分泌腺肿瘤的联合发生为特征。一些病人也可能发展成为肾上腺皮层肿瘤、类癌瘤、血管纤维瘤、胶原瘤和脂肪瘤。抑癌基因MEN1由10个外显子构成，其编码区域长1830bp，编码了一个包含610个氨基酸的蛋白，即Menin蛋白。分子生物学研究已经证实近乎10％的MEN1病人的MEN1基因发生了无义突变。目前国内外尚无一细胞株可用于筛选由于无义突变导致的多发性内分泌腺瘤病的治疗药物，因此急需建立相应的细胞株以供体外筛选由于无义突变导致的多发性内分泌腺瘤病及其它肿瘤的潜在治疗药物。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种重组人MEN1小基因及其无义突变体的稳定细胞株，该细胞株可用于筛选由于无义突变导致的肿瘤及其它疾病的治疗药物。本专利技术提供的一种重组人MEN1小基因，含有BamHⅠ序列(6bp)、外显子2+内含子2+外显子3+内含子3+外显子4+内含子4+外显子5(2928bp)、EcoRⅠ序列(6bp)、外显子6+内含子6+外显子7+内含子7+外显子8+内含子8+外显子9+内含子9+外显子10(2762bp)、HindⅢ序列(6bp)；其中7～448、2014～2222、2433～2561、2894～2934、2941～3028、3671～3807、4269～4404、4841～5005、5223～5702为外显子；其核苷酸序列为SEQIDNO：1。本专利技术提供的四种重组人MEN1小基因无义突变体，其是由所述的重组人MEN1小基因通过PCR定点突变技术分别将其核苷酸序列中424位由C突变为T(M1)、3697位由T突变为A(M2)、3697位由T突变为G(M3)、4906位由C突变为G(M4)。本专利技术提供的一种稳定细胞株，其含有上述重组人MEN1小基因。本专利技术提供的四种稳定细胞株，其分别含有上述重组人MEN1小基因无义突变体M1、M2、M3、M4。本专利技术提供的一种稳定细胞株的建立方法，包括如下步骤：1)利用基因重组技术将人MEN1小基因克隆到含有c-myc标签和HA标签的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-)中，构建成pCMV-MEN1；2)利用PCR定点突变技术，分别得到424位由C突变为T、3697位由T突变为A、3697位由T突变为G、4906位由C突变为G，人MEN1小基因无义突变质粒pCMV-MEN1-M1、pCMV-MEN1-M2、pCMV-MEN1-M3、pCMV-MEN1-M4；3)培养HeLa细胞，培养液为DMEM，添加10％胎牛血清，不添加抗生素培养，0.25％胰蛋白酶消化细胞，按2×105cell/mL密度种于6孔细胞培养板；4)利用AttracteneTransfectionReagent将质粒pCMV-MEN1、pCMV-MEN1-M1、pCMV-MEN1-M2、pCMV-MEN1-M3、pCMV-MEN1-M4分别转染HeLa细胞，24hr后，胰酶消化细胞，按照1：10稀释种于6孔细胞培养板中，培养基中加入G418(终浓度为400μg/mL)筛选，每2～4天更换一次含有G418的培养液；5)G418筛选15～20天，6孔板出现细胞克隆团，挑取细胞克隆团通过RT-PCR鉴定，阳性克隆采用有限稀释法在96孔板中进行单克隆化培养；6)待96孔板中单细胞长至汇合度80％以上，进行传代培养，并通过RT-PCR进行鉴定；7)RT-PCR鉴定为阳性单克隆，扩大培养，提取基因组，进行PCR鉴定，最终获得五种稳定细胞株HMEN1-WT、HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3和HMEN1-M4；8)将上述五种细胞株冻于液氮中保藏。本专利技术的有益效果：本专利技术建立的稳定细胞株HMEN1-WT基因组整合野生型的人MEN1小基因；HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3、HMEN1-M4分别整合MEN1小基因的无义突变体M1、M2、M3、M4。本专利技术建立的上述五种稳定细胞株，可用于无义突变导致肿瘤的治疗药物的筛选。附图说明：图1是重组人MEN1小基因结构示意图。该小基因含有BamHⅠ序列(6bp)、外显子2+内含子2+外显子3+内含子3+外显子4+内含子4+外显子5(2928bp)、EcoRⅠ序列(6bp)、外显子6+内含子6+外显子7+内含子7+外显子8+内含子8+外显子9+内含子9+外显子10(2762bp)、HindⅢ序列(6bp)。图2是重组人MEN1小基因表达载体鉴定图。泳道1是pcDNA3.1(-)空质粒；泳道2是重组质粒pCMV-MEN1；泳道3是重组质粒pCMV-MEN1的PCR鉴定。图3是重组人MEN1小基因转染HeLa细胞的RT-PCR鉴定图。泳道1为未转染细胞的阴性对照；泳道2为重组人MEN1小基因转染细胞。图4是重组人MEN1小基因无义突变体测序鉴定图谱。图5是利用实时荧光定量PCR检测重组人MEN1小基因及其无义突变体稳定细胞株mRNA表达水平。图6是利用Westernblot检测不同浓度的通读药物PTC124处理稳定细胞株后全长MEN1蛋白的表达水平。具体实施方式实施例11、重组人MEN1小基因表达载体的构建利用BamHⅠ和HindⅢ对人MEN1小基因进行双酶切得到5.7kb的基因片段，电泳回收。含有c-myc标签和HA标签的哺乳动物高效表达载体pcDNA3.1(-)也使用BamHⅠ和HindⅢ双酶切成线性载体，电泳回收。将其与回收的人MEN1小基因片段使用T4DNA连接酶连接，得到重组质粒pCMV-MEN1，重组质粒经PCR鉴定。2、重组人MEN1小基因无义突变体的构建设计四对部分序列互补的突变引物，分别使424位由C突变为T(M1)、3697位由T突变为A(M2)、3697位由T突变为G(M3)、4906位由C突变为G(M4)，使用高保真酶以重组质粒pCMV-MEN1为模板进行PCR扩增，产物经DpnⅠ消化模板，取10μL产物转化细菌，挑取克隆提取质粒，测序鉴定，分别得到突变质粒pCMV-MEN1-M1、pCMV-MEN1-M2、pCMV-MEN1-M3、pCMV-MEN1-M4。3、HeLa细胞的培养与传代细本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人MEN1小基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
1.一种重组人MEN1小基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：1。2.一种重组人MEN1小基因无义突变体M1，其是由权利要求1所述的重组人MEN1小基因通过PCR定点突变技术将其核苷酸序列中424位由C突变为T。3.一种重组人MEN1小基因无义突变体M2，其是由权利要求1所述的重组人MEN1小基因通过PCR定点突变技术将其核苷酸序列中3697位由T突变为A。4.一种重组人MEN1小基因无义突变体M3，其是由权利要求1所述的重组人MEN...
【专利技术属性】
技术研发人员：柴宝峰，王刚，刘静，贾辰亮，申泉，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14
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