一种活化肿瘤免疫应答的基因修饰干细胞制备方法技术

本发明专利技术提供了一种活化肿瘤免疫应答的间充质干细胞及其应用，属于生物医药领域。本发明专利技术通过采用基因工程手段使间充质干细胞表达抗CTLA

【技术实现步骤摘要】
一种活化肿瘤免疫应答的基因修饰干细胞制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种活化肿瘤免疫应答的基因修饰干细胞制备方法。

技术介绍

[0002]细胞是构成人体的基本单位，数目庞大且功能不同的细胞相互协同以维持人体的正常生理功能。在正常生理状态下，人体细胞的生长、分裂、寿命、运动和生物学功能会受到严格的管理和控制，主要遵循三个基本规律：1.未被允许的情况不能进行分裂；2.每个细胞都有自己固定的物理范围，不得随意在体内移动；3.每个细胞都有预定的寿命。一旦以上一种或者全部规则被打破，细胞就会处于病理的不受控状态，如果不能被及时纠正，最终会发展为“完全失控”的状态，即为癌症的发生。因此癌细胞具有不受控制的分裂、丧失正常生物学功能、细胞寿命比预期要长很多、侵袭其他组织以及通过竞争血液和养分来影响其他组织的正常功能等特点。
[0003]肿瘤细胞由自体正常细胞逐步突变而来，因此其细胞表面蛋白跟自体正常细胞高度相似，缺乏激活免疫系统的非己信号因子(例如：PAMP)。同时，肿瘤细胞可以对肿瘤组织内的微环境进行改造，使肿瘤组织内呈现一种免疫抑制的状态。例如肿瘤细胞可以分泌抑制型细胞因子IL
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10和TGF
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b，同时高表达CTLA
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4L和PD
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1L，抑制活化的CTLs。其次，炎症反应也可以促进肿瘤的发生。肿瘤相关的炎症反应包括在肿瘤发生前已经存在的炎症(例如慢性感染，化学物质刺激等)，以及伴随肿瘤发生产生的炎症反应。这些炎症反应可以在肿瘤组织局部释放大量抑制型细胞因子，并募集巨噬细胞、中性粒细胞以及MDSC等起抑制作用的细胞。例如，肿瘤组织中的巨噬细胞可以通过多种途径对免疫系统进行压制。
[0004]细胞毒性T淋巴细胞相关抗原
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4(Cytotoxic T Lymphocyte
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Associated Antigen
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4，CTLA
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4)，又称CD152，是由CTLA
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4基因编码的T细胞表面跨膜蛋白，其基因定位于2号染色体长臂3区3带(2q33)。CTLA
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4是目前已知最重要的免疫抑制性受体之一，主要表达在活化的CD4
+
和CD8
+
T淋巴细胞及激活的B淋巴细胞表面。CTLA
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4可与APC，如树突状细胞(DC)表面的B7家族分子(B7
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1/CD80、B7
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2/CD86)特异结合，作为协同刺激信号抑制T细胞的增殖活化；阻抑细胞周期演进；降低IL
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2、IFN
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γ、IL
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4等细胞因子的分泌及IL
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2受体的表达，从而负性调节T细胞的增殖。CTLA
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4在静止T细胞中表达水平很低，但当T细胞被显著激活2
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3天后其表达水平显著上调，从而防止T细胞的过度活化，使机体的免疫反应控制在一个平稳的水平。CTLA
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4的结构与CD28的结构极为相似，都能与B7
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1/B7
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2分子特异性结合，但CD28与B7结合对T细胞活化起正向调节作用，相反的，CTLA
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4作为CD28的拮抗剂与B7结合后，对T细胞的活化起负性调节作用，通过抑制T细胞活性使肿瘤细胞逃脱机体的免疫监视和制裁。因此，CTLA
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4被认为是抑制机体抗肿瘤的免疫分子，是目前肿瘤靶向免疫治疗的热点及方向。而CTLA
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4单抗的研发针对该信号通路，通过抑制CTLA
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4与B7分子的特异结合，从而达到调节肿瘤免疫的作用。
[0005]专利CN201911250591.7公开了一种纳米抗体基因修饰的间充质干细胞及其制备
方法与应用，该间充质干细胞含有、和/或表达、和/或分泌纳米抗体，所述的抗体包括免疫检查点抑制剂，优选自PD
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1抗体、PD
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L1抗体、CTLA
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4抗体、LAG
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3抗体、TIM
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3抗体、TIGIT抗体和VISTA抗体中的一种或多种。该间充质干细胞或该间充质干细胞的培养提取物，迁移至目标靶位的同时，使得纳米抗体能够在较短时间精准到达病灶区，提高病灶区纳米抗体的浓度和有效量，并减弱病灶区纳米抗体的衰竭现象，还促进间充质干细胞分泌其他有益成分，提高间充质干细胞介导的细胞免疫治疗，提高免疫相关性疾病的治疗效果。专利CN201580045089.6则公开了一种基因修饰间充质干细胞(MSC)及其在肿瘤治疗中的医学用途，该MSC包含一种或多种外源核酸分子，其中外源核酸分子包括编码一种或多种免疫应答刺激细胞因子或免疫应答调节细胞因子的区域，该区域可操作地连接于启动子或启动子/增强子组合，本专利技术涵盖所述细胞在调节肿瘤微环境以吸引免疫效应细胞并促进其激活和/或记忆表型过继的用途。本专利技术另一方面涉及所述细胞在包括联合施用间充质干细胞与抗肿瘤免疫治疗剂的抗肿瘤治疗中的用途，抗肿瘤免疫治疗剂如检查点抑制剂；免疫细胞，例如T细胞，如具有人工T细胞受体，例如嵌合抗原受体(CAR
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T)的T细胞，或外源T细胞受体(TCR)转导的细胞，NK细胞或巨噬细胞/单核细胞；或癌症疫苗。
[0006]治疗性单克隆抗体药物具有先进的抗癌功能，但是抗体的免疫原性、肿瘤靶点长期使用的耐受性以及单纯性阻断信号转导通路的长期效果等问题仍有待进一步研究，多数单抗治疗肿瘤需要100mg以上的起始剂量，因此易引起多种严重副作用，且很难实现对肿瘤细胞的长期有效抑制和杀伤作用。
[0007]基于此，亟需一种新的方法解决上述单抗的不足，用于制备活化肿瘤免疫应答的药物。

技术实现思路

[0008]针对上述不足，本专利技术提供了一种活化肿瘤免疫应答的间充质干细胞及其应用。本专利技术通过采用基因工程手段使间充质干细胞表达CTLA
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4单抗融合蛋白，特异性结合高表达CTLA
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4的Treg细胞，从而抑制肿瘤细胞免疫逃逸，达到治疗肿瘤相关疾病的目的。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0010]一方面，本专利技术提供了一种抗CTLA
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4单克隆抗体融合蛋白(简称“CTLA
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4单抗融合蛋白”或“融合蛋白”)的编码核苷酸，所述的编码核苷酸包含编码CTLA
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4抗体的核苷酸。
[0011]具体地，所述的编码CTLA
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4抗体的核苷酸包含编码CTLA
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4抗体轻链可变区VL的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、和编码CTLA
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4抗体重链可变区VH的SEQ ID NO:4或SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CTLA
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4单抗融合蛋白的编码核苷酸，其特征在于：所述的编码核苷酸包含编码CTLA
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4抗体的核苷酸；所述的编码CTLA
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4抗体的核苷酸包含编码CTLA
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4抗体轻链可变区VL的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、和编码CTLA
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4抗体重链可变区VH的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为：GAAATTGTACTTACTCAGAGTCCCGGCACACTCAGTCTGTCACCAGGAGAGAGGGCGACTCTTTCATGCCGCGCAAGTCAGAGCGTAGGTAGCAGTTACCTTGCGTGGTATCAACAAAAGCCCGGCCAGGCACCCCGCCTTCTTATATACGGTGCGTTTTCTCGCGCTACAGGCATCCCAGACCGATTCTCTGGATCTGGGTCCGGTACGGATTTCACTTTGACAATATCCAGGTTGGAACCGGAGGACTTTGCGGTGTATTATTGCCAACAATACGGGAGCTCCCCTTGGACGTTCGGGCAGGGGACCAAAGTCGAAATCAAG；所述的SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为：CAAGTACAACTCGTCGAGTCCGGCGGTGGGGTAGTGCAGCCTGGTAGAAGTCTCCGATTGTCTTGTGCCGCAAGCGGCTTCACCTTCAGTAGCTATACAATGCATTGGGTTCGACAAGCCCCAGGCAAGGGGTTGGAGTGGGTCACTTTCATCAGTTATGATGGCAACAATAAATACTACGCGGACTCAGTGAAAGGTCGCTTTACTATTTCCCGAGATAATTCAAAGAATACACTTTATTTGCAAATGAATTCACTGAGAGCAGAGGATACAGCGATATACTACTGTGCTAGAACGGGTTGGTTGGGGCCCTTCGACTACTGGGGCCAAGGGACACTTGTCACGGTCTCTTCA；所述的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为：GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCGTGGGCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACGGCGCCTTCAGCAGGGCCACCGGCATCCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGGCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG；所述的SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为：CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCAGGAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGACCTTCATCAGCTACGACG...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘广洋，刘拥军，张晨亮，李欣，米一，
申请(专利权)人：北京贝来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：