用于治疗高级别脑胶质瘤的基因修饰间充质干细胞及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种能够修饰间充质干细胞的融合基因，包含：1)编码分泌信号蛋白的核苷酸序列；2)编码NLGN‑3阻断蛋白的核苷酸序列；以及3)编码人IgG1 Fc片段的核苷酸序列。所述融合基因可以用于修饰间充质干细胞以表达NLGN‑3的拮抗剂，通过特异性阻断NLGN‑3与NRXN的结合，从而抑制脑胶质瘤增殖。本发明专利技术还公开了一种抑制脑胶质瘤，特别是高级别脑胶质瘤增殖的间充质干细胞及其制备方法和应用。

【技术实现步骤摘要】
用于治疗高级别脑胶质瘤的基因修饰间充质干细胞及其制备方法
本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及一种治疗高级别脑胶质瘤(Highgradeglioma,HGG)的基因修饰间充质干细胞，利用间充质干细胞对肿瘤组织特异的趋化作用，选择性特异靶向高级别脑胶质瘤细胞，通过抑制胶质瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞的凋亡从而治疗脑胶质瘤。本专利技术还涉及该基因修饰间充质干细胞的制备方法和应用。
技术介绍
脑胶质瘤(BrainGlioma)是起源于神经外胚层的肿瘤，约占成人颅内肿瘤的30％一50％，是颅内最常见的肿瘤，它具有恶性级别进行性升高、高度浸润性、生存期短，容易复发、死亡率高等特点。目前，脑胶质瘤的治疗仍以手术及术后放化疗为主，然而由于胶质瘤呈浸润性生长，恶性增殖能力强以及向周围脑组织的侵袭能力迅速，且对化疗药物的低敏感性等原因，常在治疗后复发，同时手术和放化疗也会损伤正常的大脑组织细胞，因此胶质瘤治疗目前仍是医学领域中的一大难题，特别是高级别脑胶质瘤(Highgradeglioma,HGG)的五年生存率不足10％，死亡率高达90％以上。与其他治疗手段相比，基于基因工程化的干细胞疗法在脑胶质瘤治疗中展现出更大优势。其主要策略是利用包括间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)在内的成体干细胞对肿瘤组织的靶向性，以干细胞作为基因工程载体，将对肿瘤具有杀伤作用的药物或生物制剂基因导入干细胞中，从而使抗肿瘤药物随干细胞特异性输送到肿瘤组织中，杀伤肿瘤细胞。然而，目前存在的问题是，基因工程化干细胞携带的抗肿瘤蛋白，包括CD/5-FC、tTRAIL、HSV-TK及溶瘤病毒等在内，因其对细胞杀伤作用，均会不同程度的损伤正常的大脑组织和细胞；其中发表在Lancet(2000年)的文章曾指出，用于脑胶质瘤治疗的tTRAIL蛋白可引起正常的脑细胞死亡，从而对大脑功能造成不可逆影响。基于此，亟需一种新的途径解决上述抗肿瘤药物的不足，用于制备治疗脑胶质瘤的药物。本专利技术依据间充质干细胞对肿瘤的靶向作用，旨在利用间充质干细胞作为载体，携带可特异性阻断脑胶质瘤增殖及活化通路的阻断剂(如NLGN-3拮抗剂)并将其输送至脑胶质瘤组织中，从而达到精准抑制脑胶质瘤发展的目的。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于通过基因修饰的方法，使间充质干细胞特异表达NLGN-3的拮抗剂，通过特异性阻断NLGN-3与NRXN的结合，从而抑制脑胶质瘤增殖，达到治疗高级别脑胶质瘤的目的。本专利技术的专利技术人对脑胶质瘤的发生、发展及增殖进行了大量研究。根据最新研究发现，Neuroligin-3(NLGN-3)的异常表达与高级别脑胶质瘤的增殖和活化具有高度相关性。Neuroligin-3是神经配体(Neuroligin，NLGN)家族成员之一，是突触后膜上的一种细胞黏附蛋白，能够介导神经元之间突触的形成和维持，参与保持正常的神经活动。而在高级别脑胶质瘤患者脑内，NLGN3能够通过与突触蛋白NRXN结合，从而启动下游信号通路，促进高级胶质瘤细胞的生长，并产生更多游离状态NLGN-3，进一步促进胶质瘤的进展。而敲除NLGN-3或特异阻断NLGN3与NRXN的结合通路，可抑制脑胶质瘤的发展。本专利技术制备的基因修饰间充质干细胞可高表达NLGN-3的拮抗剂，通过特异性阻断NLGN-3与NRXN的结合，从而抑制脑胶质瘤增殖，达到治疗高级别脑胶质瘤的目的。同时，与现有的技术相比，本专利技术的策略是特异靶向NLGN-3蛋白信号通路，而对正常脑细胞没有杀伤或凋亡作用，从而最大限度的保护正常脑组织。本专利技术的第一方面在于提供一种能够修饰间充质干细胞的融合基因，其特征在于，包含：1)编码分泌信号蛋白的核苷酸序列；2)编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列；以及3)编码人IgG1Fc片段的核苷酸序列。根据本专利技术的融合基因可以用于修饰间充质干细胞以特异表达NLGN-3的拮抗剂，通过特异性阻断NLGN-3与NRXN的结合，从而抑制脑胶质瘤增殖，达到治疗高级别脑胶质瘤的目的。作为本专利技术的一种实施方式，所述编码分泌信号蛋白的核苷酸序列为编码tPA、IL-2或SEC等蛋白分子的核苷酸序列；优选地，所述编码分泌信号蛋白的基因序列为编码tPA分子的核苷酸序列；更优选地，所述编码分泌信号蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo.1。通过在本专利技术中添加信号肽分子来帮助NLGN-3阻断蛋白分泌到细胞外从而发挥作用。作为本专利技术的一种实施方式，所述编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列为编码蛋白Neurexin-1β(NRXN-1β)胞外区或NLGN-3特异单克隆抗体的核苷酸序列；优选地，所述编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo.2。作为本专利技术的一种实施方式，所述编码人IgG1Fc片段的核苷酸序列由IgG1的重链恒定区CH2和CH3以及铰链区三部分组成；优选地，所述编码人IgG1Fc片段的核苷酸序列为SEQIDNo.3。在一个优选实施方式中，所述编码分泌信号蛋白的核苷酸序列、所述编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列、所述编码人IgG1Fc片段的核苷酸序列依次串联组成如SEQIDNo.4所示的序列。本专利技术的第二方面在于提供一种能够抑制脑胶质瘤细胞，特别是高级别脑胶质瘤增殖的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞通过基因修饰的方法，表达特异性阻断NLGN-3与NRXN蛋白结合的融合蛋白。作为本专利技术的一种实施方式，所述融合蛋白由本专利技术的融合基因编码。作为本专利技术的一种实施方式，基因修饰采用的技术为利用病毒表达载体转染、脂质体转染、电转移、mRNA转染或Crispr/Cas9基因编辑的方法转染至间充质干细胞的技术；优选地，所述基因修饰为病毒转染技术；更优选地，所述基因修饰为慢病毒转染技术；更优选地，所述基因修饰为第四代慢病毒转染技术。作为本专利技术的一种实施方式，间充质干细胞包括但不限于骨髓组织、脂肪组织、脐带组织或胎盘组织来源的间充质干细胞；优选地，间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。作为本专利技术的一种实施方式，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞，通过慢病毒转染技术将tPA-NRXN1β-IgG1融合基因导入人脐带间充质干细胞中，从而使间充质干细胞能够表达tPA、NRXN1β及IgG1蛋白。作为一种优选的技术方案，所述干细胞为从新生儿的脐带组织经过爬片培养法培养获得分离的脐带间充质干细胞。本专利技术的第三方面在于提供一种根据本专利技术的间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括：(1)利用病毒载体系统构建特异性阻断NLGN-3与NRXN蛋白结合的融合基因载体质粒，(2)将所述融合基因载体质粒与包装质粒一起导入293T细胞，收获病毒；以及(3)将收获的病毒转染至间充质干细胞，筛选被病毒转染的间充质干细胞；优选地，间充质干细胞的制备方法包括：(1)构建tPA-NRXN1β-IgG1融合基因，并采用慢病毒载体系统构建pLV-CMV-tPA-NRXN1β-IgG1融合基因载体质粒(以下简称：pLV-NRXN1β-IgG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于修饰间充质干细胞的融合基因，其特征在于，包含：1)编码分泌信号蛋白的核苷酸序列；2)编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列；以及3)编码人IgG1 Fc片段的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于修饰间充质干细胞的融合基因，其特征在于，包含：1)编码分泌信号蛋白的核苷酸序列；2)编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列；以及3)编码人IgG1Fc片段的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述编码分泌信号蛋白的核苷酸序列为编码tPA、IL-2或SEC分子的核苷酸序列；优选地，所述编码分泌信号蛋白的核苷酸序列为编码tPA分子的核苷酸序列；更优选地，所述编码分泌信号蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo.1；
所述编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列为蛋白Neurexin-1β胞外区或NLGN-3特异单克隆抗体的核苷酸序列；优选地，所述编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo.2；
所述编码人IgG1Fc片段的核苷酸序列由IgG1的重链恒定区CH2和CH3以及铰链区三部分组成；优选地，所述编码人IgG1Fc片段的核苷酸序列为SEQIDNo.3。


3.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述编码分泌信号蛋白的核苷酸序列、所述编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列、所述编码人IgG1Fc片段的核苷酸序列依次串联组成如SEQIDNo.4所示的序列。


4.一种能够抑制脑胶质瘤细胞，特别是高级别脑胶质瘤细胞增殖的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞通过基因修饰的方法，表达特异性阻断NLGN-3与NRXN蛋白结合的融合蛋白，所述融合蛋白由权利要求1-3任一项所述的融合基因编码。


5.根据权利要求4所述的间充质干细胞，其特征在于，所述基因修饰采用的技术为利用病毒表达载体转染、脂质体转染、电转移、mRNA转染或Crispr/Cas9基因编辑的方法转染至间充质干细胞的技术；优选地，所述基因修饰为病毒转染技术；更优选地，所述基因修饰为慢病毒转染技术；更优选地，所述基因修饰为第四代慢病毒转染技术。


6.根据权利要求4所述的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓组织、脂肪组织、脐带组织或胎盘组织来源的间充质干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘广洋，刘拥军，张晨亮，李欣，米一，龙浩淼，
申请(专利权)人：北京贝来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11