同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法。本发明专利技术采用禽流感H5亚型和H9亚型的血凝素抗原为核心抗原，合成融合基因H5H9HA，并采用腺病毒作为载体，把融合基因H5H9HA克隆到腺病毒穿梭载体pDC315上，然后与骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染入293细胞中，完成重组腺病毒的生产，再经过扩增和纯化，得到高纯度的携带血凝素抗原的重组腺病毒rAd‑H5H9HA，经过冻干和包装后处理，得到同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗。该疫苗能够诱导高水平的H5亚型特异性抗体和H9亚型特异性抗体，抗体的水平与目前商业用的全病毒灭活疫苗相一致，超出了国家规定的免疫标准，在禽流感免疫预防领域具备巨大的应用前景和推广价值。

【技术实现步骤摘要】
同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法
本专利技术涉及生物制品
，尤其涉及一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法。
技术介绍
禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类的急性、烈性、接触性呼吸道传染病，禽流感可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。高致病性禽流感已在亚洲一些国家成为地方流行性疾病，被世界动物卫生组织(OIE)列为“通报性动物疫病”，在我国也被列为一类动物传染病。禽流感不仅可以感染禽类，也可以感染人类及其他的哺乳动物，因此对禽流感的防制具有公共卫生学意义。禽流感根据AIV血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同可分为16个HA亚型，9个NA亚型，目前我国主要流行H5和H9亚型。H5亚型高致病性禽流感的威胁仍然很大，近10余年来H5亚型毒株仍是在全国流行的优势毒株，而H5N6亚型发病的比例成上升趋势，是造成的损失比较严重的一个亚型之一；与此同时，近年来H9N2亚型禽流感在我国养禽业中呈地方性流行，呈现感染日龄早、发病率和死亡率增高、传播速度加快等特点，对养鸡业持续造成威胁。因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合基因H5H9HA，其特征在于：所述融合基因H5H9HA由禽流感H5亚型血凝素抗原HA基因和禽流感H9亚型血凝素抗原HA基因融合而成；所述融合基因H5H9HA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合基因H5H9HA，其特征在于：所述融合基因H5H9HA由禽流感H5亚型血凝素抗原HA基因和禽流感H9亚型血凝素抗原HA基因融合而成；所述融合基因H5H9HA的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。


2.一种重组腺病毒rAd-H5H9HA，其特征在于：所述重组腺病毒rAd-H5H9HA包含权利要求1所述的融合基因H5H9HA。


3.一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗，其特征在于：所述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗包含权利要求2所述的重组腺病毒rAd-H5H9HA。


4.一种权利要求3所述的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1，质粒pUC57-H5H9HA的制备：首先，制备所述融合基因H5H9HA，然后，在所述融合基因H5H9HA序列的一端加上kozak序列后再增加EcoRI酶切位点，在另一端加上NheI酶切位点；然后，将预处理后的融合基因H5H9HA克隆到载体pUC57中，得到带有目的融合基因H5H9HA的所述质粒pUC57-H5H9HA；
S2，腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA的构建：采用限制性内切酶EcoRI和NheI对腺病毒穿梭载体pDC315和所述质粒pUC57-H5H9HA进行双酶切处理，得到双酶切后的腺病毒穿梭载体pDC315片段和双酶切后的融合基因H5H9HA片段，然后进行连接反应，得到所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA；
S3，重组腺病毒载体的包装和扩繁：运用AdMax腺病毒包装体系，将步骤S2制备的所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA进行包装和扩繁，得到四代重组腺病毒rAd-H5H9HA；
S4，重组腺病毒rAd-H5H9HA的PCR鉴定及扩增纯化：设计所述融合基因H5H9HA的上游引物和下游引物，进行PCR鉴定、扩增和纯化处理，得到大量纯化后的所述重组腺病毒rAd-H5H9HA，然后进行冻干、分装处理，制备得到所述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗。


5.根据权利要求4所述的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，所述融合基因H5H9HA的合成工艺包括如下步骤：
A1，筛选禽流感H5N6亚型和H9N2亚型的优势毒株，并确定前述毒株的HA基因序列；
A2，将所述H5N6亚型HA基因序列中的终止密码子及后续序列去除，然后紧接续所述H9N2亚型的HA基因序列中的起始密码子，直至所述H9N2亚型的HA基因序列的终止密码子，基因融合处理，得到融合基因H5H9HA；
其中，所述融合基因H5H9HA为采用全序列人工合成的方法合成得到，或者采用PCR扩增的方法分别获得编码H5N6亚型HA抗原和H9N2亚型HA抗原的DNA序列，然后拼...

【专利技术属性】
技术研发人员：王增利，周立桥，张哲，李金华，霍惠玲，韩荞忆，胡晓悦，马贵达，顾文源，马宏伟，韩庆安，刘天驹，仇国明，甄理，段英萍，
申请(专利权)人：河北省动物疫病预防控制中心，天津保信立德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13