一种间充质干细胞生物学效力的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种间充质干细胞生物学效力的检测方法，其特征在于通过ELISA方法检测间充质干细胞培养上清中表达分泌型TNFRI的水平来判断该细胞免疫抑制能力强弱，操作简便，针对性强，定量准确，为间充质干细胞提供了较好的生物学效力检测手段。

A test method for biological efficacy of mesenchymal stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞生物学效力的检测方法
本专利技术涉及一种间充质干细胞的检测技术，具体地说，涉及一种间充质干细胞生物学效力的检测方法，通过检测间充质干细胞培养上清中抗炎因子水平作为间充质干细胞生物学效力的质量控制标准。
技术介绍
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要的免疫调节和前炎性因子，因其在类风湿关节炎、溃疡性结肠炎等自身免疫性疾病中的表现上调而被认为在其病理机制中发挥重要作用。在类风湿关节炎中TNF-α主要产生于RA滑膜中的滑膜巨噬细胞并刺激纤维母细胞增殖及淋巴细胞的活性。TNF-α生成的过程始于配体和细胞表面Toll样受体(TLR)结合，刺激信号转导通路而激活NF-κB转录因子。被激活的NF-κB进入细胞核并诱导与炎症有关基因的转录，而TNF-α和其它炎性细胞因子的生成又募集其它炎性细胞依次释放细胞因子进而放大免疫反应。许多动物实验及临床研究均证实阻滞TNF-α活性对治疗类风湿关节炎、溃疡性结肠炎等众多自身免疫性疾病有效。临床研究发现，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)可显著(实质上)抑制类风湿关节炎病人体内活化的淋巴细胞，降低TNF-α水平，从而发挥免疫抑制及抗炎的特性，使得其在治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病方面具有广阔的应用前景。然而，由于细胞治疗本身的特点，间充质干细胞用于临床治疗还具有某些方面的限制因素。其中最典型的方面是缺乏有效而快捷的具有针对性的生物学效力检测手段。目前多数临床前或临床使用的间充质干细胞产品都是参照2006年国际细胞治疗协会提出的三条定义间充质干细胞标准[2]，而缺乏针对某一类疾病，特别是免疫抑制方面的可以定义细胞质量或初步判断细胞治疗效果的方法。国际细胞治疗协会(ISCT)于2015年的第21次干细胞年会明确提出：间充质干细胞应建立用于自身免疫性疾病临床治疗的标准，并建议将间充质干细胞分泌的抗炎因子作为检测间充质干细胞生物学效力的标准(JacquesGalipeau,etal,.2016,Cytotherapy18(2),151-159)。而基于免疫细胞分泌的TNF-α与类风湿关节炎有密切的相关性，目前对间充质干细胞生物学效力检测方法的通用做法是：利用健康人新鲜外周血中分离的淋巴细胞在PHA刺激下可分泌大量TNF-α，而间充质干细胞与外周血单核细胞1:1至1:10共培养均可显著抑制后者分泌TNF-α的水平，且抑制水平与间充质干细胞浓度呈正相关。该方法是根据间充质干细胞治疗类风湿关节炎所发挥的免疫抑制和抗炎特性而设计的有针对性的检测手段，可在体外检测间充质干细胞的免疫抑制能力。然而在实际操作中发现该方法具有下述弊端：1.每次检测均需要抽取健康人新鲜血液，给检测带来不便；2.每次检测所取人外周血淋巴细胞来源于不同供者，因此批次之间存在不稳定性；3.该方法可提供间充质干细胞生物学效力的定性结果，然而无法给出定量指标；4.该方法需要先复苏培养间充质干细胞后接种至96孔板，然后与外周血淋巴细胞(加入PHA等刺激剂)共培养48-72小时，最后检测培养液中TNF-α水平，整个实验需要6-7天，步骤繁多、工序复杂。因此建立急需一种无需抽取人体新鲜血液，批次间稳定性高，耗时短，工序简单的间充质干细胞生物学效力的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有间充质干细胞生物学效力检测手段的不足，建立一套有效检测间充质干细胞生物学效力的新方法。基于上述考虑，我们对间充质干细胞的生物学效力进行了深入研究。TNFRI(肿瘤坏死因子受体I)是TNF-α的主要受体之一，作为细胞膜受体可通过结合TNF-α而启动下游信号，诱导肿瘤凋亡。而膜表达型的TNFRI(mTNFRI)可通过金属蛋白酶剪切产生可溶性TNFRI(sTNFRI),因此可通过ELISA试剂盒检测血清或细胞培养上清液中的TNFRI水平。我们的研究发现，不同批次的脐带间充质干细胞在体外培养过程中均可稳定分泌sTNFRI(细胞培养48小时：TNFRI分泌水平为300pg-500pg/106细胞)。我们的研究进一步发现，sTNFRI分泌水平与脐带间充质干细胞免疫抑制能力(如人脐带间充质干细胞在体外抑制人淋巴细胞分泌TNF-α的能力)具有显著相关性(R>0.9)，而下调TNFRI的表达则可显著(实质上)抑制间充质干细胞的免疫调节能力。因此我们期望能通过检测间充质干细胞培养上清中TNFRI水平作为间充质干细胞生物学效力的质量控制标准。本专利技术的第一方面提供了一种间充质干细胞生物学效力的检测方法，所述方法包括检测间充质干细胞分泌可溶性TNFRI的水平，从而判定间充质干细胞生物学效力，优选地，所述生物学效力为免疫抑制能力。所述间充质干细胞可以为骨髓组织、脂肪组织、脐带组织或胎盘组织来源的间充质干细胞；优选地，作为本专利技术的一种实施方案，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。在特定的实施例中，我们采用ELISA方法检测间充质干细胞培养过程中可分泌较高水平的可溶性TNFRI(sTNFRI)，进一步实验发现，通过siRNA技术不同程度抑制sTNFRI表达后，间充质干细胞的免疫抑制能力(如人脐带间充质干细胞在体外抑制人淋巴细胞分泌TNF-α的能力)显著下降，且其抑制能力下降水平与sTNFRI表达下降水平呈显著相关性(R>0.9)；由此可知，间充质干细胞免疫抑制能力与sTNFRI水平正相关；进一步的研究表明，当间充质干细胞表达sTNFRI的水平在215pg(106细胞培养48小时)以上时，其免疫抑制能力高于70％。由以上的实验结果可知，我们定义了间充质干细胞的生物学效力检测标准：106个间充质干细胞在体外培养48小时，其表达sTNFRI的水平应该在215pg以上，低于此数值则判定为间充质干细胞免疫抑制能力不合格。我们的研究发现TNFRI表达与间充质干细胞免疫抑制能力之间存在密切关系，并在此基础上开发出一套有效检测间充质干细胞免疫抑制能力的方法。本专利技术以ELISA检测MSC培养过程中分泌sTNFRI为主要检测方法，针对性强，操作简便，定量准确，为间充质干细胞提供了较好的生物学效力检测手段。作为本专利技术的一种实施方案，所述方法包括检测所述间充质干细胞在体外例如在细胞培养上清液中分泌的可溶性TNFRI；优选地，通过ELISA方法检测不同批次脐带来源间充质干细胞在体外培养上清液中TNFRI的含量。其中，所述间充质干细胞的免疫抑制能力与可溶性TNFRI水平正相关；优选地，当细胞培养48小时后，所述间充质干细胞表达可溶性TNFRI的水平为215pg/106细胞以上时，判定其免疫抑制能力大于70％。作为本专利技术的一种实施方案，其判断标准为：每1x106个间充质干细胞在48小时内表达可溶性TNFRI的水平为215pg以上，低于此标准则判定为间充质干细胞生物学效力不合格。本专利技术的第二方面提供了上述所述间充质干细胞生物学效力的检测方法在细胞种子库、工作库及注射液的检测及其质量检测标准的制定方面的应用。本专利技术的第三方面提供了一种检测可溶性TNFRI水平的试本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞生物学效力的检测方法，其特征在于，所述方法包括检测间充质干细胞分泌可溶性TNFRI的水平，从而判定间充质干细胞生物学效力，优选地，所述生物学效力为免疫抑制能力。/n

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞生物学效力的检测方法，其特征在于，所述方法包括检测间充质干细胞分泌可溶性TNFRI的水平，从而判定间充质干细胞生物学效力，优选地，所述生物学效力为免疫抑制能力。


2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓组织、脂肪组织、脐带组织或胎盘组织来源的间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。


3.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，所述方法包括检测所述间充质干细胞在体外例如在细胞培养上清液中分泌的可溶性TNFRI；优选地，通过ELISA方法检测不同批次脐带来源间充质干细胞在体外培养上清液中TNFRI的含量。


4.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，所述间充质干细胞的免疫抑制能力与可溶性TNFRI水平正相关；优选地，所述检测方法的判断标准为：每1x106个间充质干细胞在48小时内表达可溶性TNFRI的水平为215pg以上，低于此标准则判定为间充质干细胞生物学效力不合格；更优选地，当细胞培养48小时后，所述间充质干细胞表达可溶性TNFRI的水平为215pg/106细胞以上时，判定其免疫抑制能力大于70％。


5.根据权利要求1-4任一项所述检测方法，其特征在于，在细胞种子库、工作库及注射液的检测及其质量检测标准的制定方面的应用。


6.检测可溶性TNFRI水平的试剂在制备检测间充质干细胞免疫效力的试剂盒的应用；优选地，该检测采用的判断标准为：1x106个间充质干细胞在48小时内表达可溶性TNFRI的水平为215pg以上，低于此标准则判定为间充质干细胞生物学效力不合格。


7.一种对间充质干细胞的生物学效力进行量化的方法，其特征在于，包括：
确定所述间充质干细胞在体外如细胞培养上清液中的TNFRI分泌量；以及基于公式y＝(a+bx)×100％，以便确定所述间充质干细胞生物学效力，优选地，所述生物学效力为免疫抑制能力，
其中，
y为TNF-α抑制率(％)，x为TNFRI分泌量(pg/106细胞)，
a为0.5～0.6之间的常数，优选为0.55465，
b为0.0006～0.0007之间的常数，优选为0.00068。


8.一种确定间充质干细胞生产工艺的方法，其特征在于，包括：
(1)采用候选工艺，从组织中分离、培养间充质干细胞；
(2)利用权利要求7所述的方法对所述间充质干细胞生物学效力进行量化，得到量化结果；以及
(3)基于所述量化结果，确定最终间充质干细胞生产工艺参数；
优选地，在步骤(3)中，当所述间充质干细胞对PBMC分泌的TNF-α抑制率大于等于70％时，则选择所述候选工艺为最终生产工艺；更优选地，当所述TNF-α抑制率小于70％时，则对所述候选工艺进行优化处理，并重复步骤(1)～(2)直至所述TNF-α抑制率大于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘广洋，刘拥军，张晨亮，李欣，米一，苗丽，马静，
申请(专利权)人：北京贝来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11