本发明专利技术公开了一种基于辅酶和电子载体分别与辅酶依赖性酶形成结合物的酶电极和生物传感器。首先将酶与辅酶或电子载体分别进行交联结合，然后一起固定到电极上，当辅酶依赖性酶催化待测物时，辅酶由其氧化态变成还原态，然后经过电子载体，还原态辅酶转成其氧化态，与此同时，电子载体由氧化态变成还原态，根据电子载体的氧化电位设置电压，得到对应的氧化电流从而实现对底物的检测。此生物传感器可有效的避免以往传感器在检测辅酶依赖性酶作为催化剂催化待测物时必须外加辅酶的这一操作，可使检测无试剂化；固定化后的辅酶/电子载体与酶结合物结构稳定、不易流失、可反复使用；并且具有更高的响应值和更灵敏的检测限。
An enzyme electrode, biosensor and its preparation method and Application
【技术实现步骤摘要】
一种酶电极、生物传感器及其制备方法和用途
本专利技术属于生物电化学领域，具体涉及一种基于辅酶/电子载体与酶结合物的酶电极、生物传感器及其制备方法和用途。
技术介绍
自然界中，辅酶作为第二底物被很多酶利用。据不完全统计，有很多酶为辅酶依赖性酶，需要辅酶在反应过程中作为氢或者电子的传递体。以常见的辅酶I和辅酶II为例，NAD+或NADP+被还原成其还原态NADH或NADPH。对反应过程中产生的NADH或者NADPH的测定是构建此生物传感器的基础。然而在目前的生物传感器中存在很多问题。首先，NAD(P)H在电极表面的直接电化学氧化一般的过程为NAD(P)H→NAD(P)H+·+e-(1)NAD(P)H+·→NAD(P)·+H+(2)NAD(P)·→NAD(P)++e-(3)其中，第一步反应是整个反应中的控速步骤。实验证明，电子在NAD(P)H与裸电极之间的传递需要很高的过电势(一般为1.0V以上)，而过高的电势常常会引起电极污染，酶失活，辅酶变成二聚体等等。常见的解决的方法就是:引入电子载体。电子载体是参与氧化还原反应并且能够加速总反应的化学物质。理想的电子载体应该具有较低的氧化还原电势，较高的化学稳定性以及较快的电子传递速率。电子载体参与的NAD(P)H的氧化原理是：NAD(P)H+Mox→NAD++Mred(4)Mred→Mox+e-(5)其次，可利用NADH氧化酶也能实现辅酶的电化学氧化。黄递酶是最常见的一种NADH氧化酶，能够在萘醌类等电子载体存在下的条件先实现NADH的氧化。相比于直接引入电子载体，黄递酶的加入可以明显地提高电极表面催化的反应速度。2003年，Antiochia等以甲氨基苯酚为电子载体研究了黄递酶催化辅酶的氧化反应的反应动力学，发现黄递酶在电子载体存在下，电催化氧化NADH的速度明显增大。因此黄递酶和多种脱氢酶能够构建生物传感器。但是在此类传感器中，一般需要外加辅酶如NAD+或者NADP+，辅酶的价格昂贵，这种单次使用导致分析成本增加，并且稳定性差，不利于实际应用。此外很多文献报道，也有将辅酶、电子载体等与酶一起通过交联、包埋等方法共固定在电极上，然而此类方法因为共固定方法较复杂、难以控制、并且限制了上述物质的有效传递而造成反应速度低、测量不灵敏、响应低。
技术实现思路
针对现有生物传感器所存在的缺陷，本专利技术提供一种基于辅酶依赖性酶与辅酶/电子载体交联结合的酶电极、生物传感器及其制备方法和用途。本专利技术的酶电极以及生物传感器具有较高检测限和灵敏度、使用方便、降低成本等优点。为解决上述问题，本专利技术提供如下技术方案：根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供一种酶电极，包括基础电极，所述基础电极表面固定有第一交联结合物、第二交联结合物的至少一种，所述第一交联结合物为辅酶与辅酶依赖性酶形成的交联结合物，所述第二交联结合物为电子载体与酶形成的交联结合物。根据本专利技术的实施方案，所述至少一种应当理解为任一种或两种。当存在时，所述固定为第一交联结合物、第二交联结合物可以分别固定或者共固定。根据本专利技术的实施方案，所述辅酶可以包含活性官能团。根据本专利技术的实施方案，所述电子载体可以包含活性官能团。根据本专利技术的实施方案，所述辅酶可以选自辅酶I、辅酶II、核黄素、硫胺素、维生素B6、维生素B12、生物素、四氢叶酸、泛酸、辅酶A、辅酶Q、硫辛酸、S-腺苷蛋氨酸、谷胱甘肽、以及烟酰胺单核苷酸、1-苯甲基3-氨基甲酰-吡啶、1-甲基烟酰胺等中的至少一种。根据本专利技术的实施方案，所述辅酶依赖性酶可以选自乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、莽草酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、甘油脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、胆碱脱氢酶、肉碱3-脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胍乙酸转甲基酶、组蛋白转甲基酶、胆碱乙酰化酶、磷酸转乙酰化酶、硫辛酸乙酰转移酶、乙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶、苯丙氨酸羧化酶、1，3-丙二醇氧化还原酶、3-羟基丁酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶、丙酮酸氧化酶、转酮醇酶、NADH-Q还原酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶乙二醛酶、谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、黄递酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、核糖脱氢酶、半乳糖脱氢酶、阿拉伯糖脱氢酶、山梨醇脱氢酶、甘露醇脱氢酶、鼠李糖脱氢酶、糖醛酸脱氢酶、黄嘌呤脱氢酶、肌醇脱氢酶中的至少一种。所述与电子载体结合的酶也可选自上述辅酶依赖性酶中的一种或多种，还可选自本领域其他已知的在反应过程中需要与氢或者电子传递体共同作用的酶。根据本专利技术的实施方案，所述电子载体可以为本领域已知的除本专利技术所述辅酶外的其他具有电子传递作用的载体，例如选自硫堇类、黄素类、萘醌类、中性红、甲基紫精、苄基紫精、亚甲基蓝、甲基橙、甲基红、甲基绿、绿脓菌素、1-甲酰胺吩嗪等吩嗪类、和蒽醌-2,6-二磺酸等腐殖质类似物等中的至少一种。根据本专利技术的实施方案，所述活性官能团彼此相同或不同，例如可以独立地选自羧基、马来酰亚胺基、氨基、环氧基、巯基、苯基或醛基官能团的至少一种。根据本专利技术的实施方案，基础电极可为金电极，玻碳电极，磁性电极，丝网印刷电极，导电玻璃，碳糊电极，石墨电极，碳毡，碳布中的至少一种。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供所述酶电极的制备方法，包括将所述第一交联结合物和第二交联结合物中的至少一种固定在基础电极表面，得到所述酶电极。进一步地，所述制备方法可以包括将辅酶与辅酶依赖性酶交联结合，得到第一交联结合物；和/或将电子载体与酶交联结合，得到第二交联结合物。根据本专利技术的实施方案，具体地，所述制备方法包括如下步骤：(1)将辅酶用活性官能团修饰，得到辅酶复合物，然后将辅酶复合物和辅酶依赖性酶进行混合，交联结合，得到辅酶与辅酶依赖性酶的第一交联结合物；(2)将电子载体用活性官能团修饰，然后与酶混合，交联结合，得到酶与电子载体的第二交联结合物；(3)将所述第一交联结合物或第二交联结合物中至少一种固定到基础电极表面形成酶电极。根据本专利技术的实施方案，所述辅酶或电子载体可通过本领域已知的反应，在辅酶或电子载体的一定部位进行修饰，引入适当的官能团或间隔臂，生成辅酶或电子载体的修饰物。优选地，所述辅酶或电子载体上修饰的活性官能团是羧基、马来酰亚胺、氨基、环氧基、巯基、苯环或醛基官能团的至少一种。根据本专利技术的实施方案，所述活性官能团可以通过酰胺基团，如马来酰亚胺基团与巯基偶联，Huisgen环加成，生物素或链酶亲和素等方式中的至少一种，使得辅酶或电子载体与辅酶依赖性酶交联结合。根据本专利技术的实施方案，所述第一交联结合物或第二交联结合物与基础电极的固定可以通过本领域已知的任何适用于固定酶与电极的方法实现，所述方法包括但不限于物理吸附法、离子吸附法、包埋法、共价偶联法、交联法中的至少一种。根据本专利技术的第三方面，本专利技术还提供一种生物传感器，其以第一方面所述酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酶电极，其特征在于：包括基础电极，所述基础电极表面固定有第一交联结合物、第二交联结合物的至少一种，其中所述第一交联结合物为辅酶与辅酶依赖性酶形成的交联结合物，所述第二交联结合物为电子载体与酶形成的交联结合物。/n
【技术特征摘要】
1.一种酶电极，其特征在于：包括基础电极，所述基础电极表面固定有第一交联结合物、第二交联结合物的至少一种，其中所述第一交联结合物为辅酶与辅酶依赖性酶形成的交联结合物，所述第二交联结合物为电子载体与酶形成的交联结合物。
2.根据权利要求1所述的酶电极，其特征在于：所述固定为第一、第二交联结合物分别固定或者共固定。
3.根据权利要求1或2所述的酶电极，其特征在于：所述辅酶或电子载体包括活性官能团。
优选地，所述活性官能团彼此相同或不同，独立地选自羧基、马来酰亚胺基、氨基、环氧基、巯基、苯基或醛基官能团的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的酶电极，其特征在于：所述辅酶选自辅酶I、辅酶II、核黄素、硫胺素、维生素B6、维生素B12、生物素、四氢叶酸、泛酸、辅酶A、辅酶Q、硫辛酸、S-腺苷蛋氨酸、谷胱甘肽、以及烟酰胺单核苷酸、1-苯甲基3-氨基甲酰-吡啶、1-甲基烟酰胺等人工辅酶中的至少一种。
优选地，所述辅酶依赖性酶或者与电子载体结合的酶独立地选自乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、莽草酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、甘油脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、胆碱脱氢酶、肉碱3-脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胍乙酸转甲基酶、组蛋白转甲基酶、胆碱乙酰化酶、磷酸转乙酰化酶、硫辛酸乙酰转移酶、乙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶、苯丙氨酸羧化酶、1，3-丙二醇氧化还原酶、3-羟基丁酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶、丙酮酸氧化酶、转酮醇酶、NADH-Q还原酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶乙二醛酶、谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、黄递酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、核糖脱氢酶、半乳糖脱氢酶、阿拉伯糖脱氢酶、山梨醇脱氢酶、甘露醇脱氢酶、鼠李糖脱氢酶、糖醛酸脱氢酶、黄嘌呤脱氢酶、肌醇脱氢酶中的至少一种。
...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱之光，张以恒，宋海燕，马春玲，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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