一种新型固定化氧化还原酶电极及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种新型固定化氧化还原酶电极及其制备方法，首先通过卤代羧酸、咪唑类化合物制备修饰剂；将修饰剂与羰基二咪唑混合加入到无水二甲亚砜中，磁力搅拌反应得到活性体；将活性体加入到氧化还原酶液中透析得到酰化氧化还原酶溶液；再利用硝酸锌溶液，2‑甲基咪唑、酰化氧化还原酶溶液与聚乙烯吡咯烷酮混合溶液制备固定化氧化还原酶粉末；最后制备氧化还原酶电极。本发明专利技术结合了MOFs材料比表面积大、种类多、负载量大、结构稳定等特征，通过制备工艺的改进，将带单体的修饰酶嵌入在MOFs骨架中，既能保证固定化后酶的活性不会明显降低，又可以进一步改进酶的重复使用稳定性。

A new immobilized redox enzyme electrode and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种新型固定化氧化还原酶电极及其制备方法
本专利技术涉及固定化氧化还原酶电极的制备技术，具体涉及一种新型固定化氧化还原酶电极及其制备方法。
技术介绍
酶作为生物催化剂，在温和的反应条件下催化效率高，并具有高度的专一性和选择性，被广泛应用于生物医药，环境保护、能源，食品和化工等行业。氧化还原酶是一种在常温常压得条件下具有特殊催化功能的高效生物催化剂，催化效率比一般催化剂高出107-1013倍，并具有专一性，很多化学反应可以采用氧化还原酶作为催化剂，而且可以避免副反应。它不仅催化生物体内化学反应，而且催化非体内的化学发应。但由于氧化还原酶的组成和结构，环境对其影响较大，极易导致酶催化活性的降低。在催化过程中，随着时间的推移，酶的催化活性会逐渐下降，导致催化效率降低，也不易回收重复利用，为了解决游离氧化还原酶的这种问题，人们引入了酶固定化技术。与游离酶相比，固定化酶在节能，降低成本，保护环境，生产自动化、连续化等许多方面都是有利的。酶的固定化技术为氧化还原酶的应用开拓了广阔的前景。金属有机骨架(MOFs)是由金属离子簇与有机配体组成的三维复合结构，具有比表面积大、种类多、负载量大、结构稳定等特征，其多孔结构能够维持生物分子构型、增强生物稳定性、提高生物分子负载效率。生物或药物分子通过表面固定、扩散固定或封装固定负载在MOFs表面或内部，MOFs能够通过调节金属离子簇与有机配体设计出具有不同孔隙率、不同孔径的生物亲和性多孔骨架结构。MOFs－酶可以维持酶的稳定性，增强酶的生物活性，提高酶负载率。与其它酶固定化材料相比，MOFs可以提高酶的可重复使用率及回收率、简化酶固定化步骤、降低酶固定化成本等。同时，MOFs作为大孔隙率的金属骨架，其空间结构可以避免酶的聚集，并且使酶的构象变化可以在有限空间中受到一定程度的限制，结构刚性得到增强。专利申请200610052954.2公开了一种以碳纳米管纳米纤维为载体固定化氧化还原酶的方法，将纳米纤维用去离子水和pH7.0、离子强度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液分别冲洗3-5次，浸润；在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液中，振荡活化2-10h，而后将纳米纤维取出，用磷酸盐缓冲溶液清洗4～6次；将酶溶解于pH7.0，离子强度0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，制成浓度为0.1-1mg/mL的酶溶液；将活化的纳米纤维完全浸没于酶溶液中，密封后在25℃下振荡0.5-8h；从溶液中取出膜，用磷酸盐缓冲溶液清洗4次，可得到碳纳米管/丙烯腈共聚物复合纤维固定化酶；将固定化纳米纤维放于4℃下储存备用。该专利技术制备的固定化氧化还原酶，易于从反应体系中回收，可以重复使用，储存稳定性明显增强，但碳纳米纤维分散性差，容易使酶聚集而导致酶利用率低下。专利申请201310050672.9公开了一种反应-吸附耦合固定化氧化还原酶的制备方法，在固定化反应器中加入聚苯胺单体和蒸馏水使得溶液的摩尔浓度为0.01-0.2mol/L，用酸调节溶液pH为1.0-7.0；充分搅拌至待溶液充分混合均匀后，在-10℃-50℃条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在-10℃-50℃条件下恒温的引发剂和助剂，引发剂与单体的摩尔浓度比为1:0.3-1:5，助剂和单体的摩尔浓度比为1:1-1:10，同时加入游离氧化酶或还原酶，单体质量与酶质量比为1:0.01-1:0.1；然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于-10℃-45℃恒温条件下反应12-24h；反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物真空干燥或冷冻干燥8-24h，得到固定化酶。该专利技术制备的氧化还原酶采用吸附的方法减少了共价结合对酶活的影响，操作条件温和，生物相容性好，但吸附效率低下，不易投产。
技术实现思路
本专利技术针对共价固定化及交联方式能明显改进分子间的作用力，从而提高重复稳定性，但也严重影响了酶的活性的问题，提供一种新型的固定化方式，在保持酶活性不降低的同时，又能增强载体与酶分子间的作用力。制备了一种新型固定化氧化还原酶电极。新型MOFs材料修饰固定化氧化还原酶制备酶电极的方法，以增强酶的生物活性，提高灵敏度和稳定性。具体的，本专利技术采用的技术方案是：一种新型固定化氧化还原酶电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对氧化还原酶进行修饰：将卤代羧酸溶于乙腈中，加入咪唑类化合物，第一次磁力搅拌反应，将得到的反应产物用无水乙醚萃取，得到下层油状物质，真空干燥，得到羧酸甲基咪唑修饰剂；将羧酸甲基咪唑修饰剂与羰基二咪唑混合，加入到无水二甲亚砜中，第二次磁力搅拌，室温反应，得到活性体；将活性体加入到氧化还原酶液中，第三次磁力搅拌反应，透析，得到酰化氧化还原酶溶液；(2)制备固定化氧化还原酶：将硝酸锌加入到去离子水中，得到溶液A；将2-甲基咪唑、酰化氧化还原酶溶液与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解于去离子水中，得到溶液B；将溶液A与溶液B混合，搅拌，离心、洗涤，冻干得到固定化氧化还原酶粉末；(3)氧化还原酶电极的制备：称取固定化氧化还原酶粉末溶解在去离子水中，超声处理后得载体溶液，用移液管将载体溶液滴在电极表面，在红外灯照射下干燥电极，待电极表面干燥后得到氧化还原酶电极。进一步地，所述卤代羧酸为氯乙酸或溴丙酸；所述咪唑类化合物为1,2-二甲基咪唑或1-丁基-2甲基咪唑。进一步地，所述卤代羧酸与咪唑类化合物的摩尔比为2:1～10:1。进一步地，所述第一次磁力搅拌反应的温度为60～100℃，所述第一次磁力搅拌反应的时间为5～10h；所述第三次磁力搅拌反应的温度为0～4℃，所述第三次磁力搅拌反应的时间为8～24h。进一步地，所述羧酸甲基咪唑修饰剂与羰二咪唑的摩尔比为1:1～3:1；所述室温反应的时间为2-8h；所述活性体与氧化还原酶液的体积比为2μL:1mL～5μL:1mL，所述氧化还原酶液的浓度为150～350μM。进一步地，所述氧化还原酶液中的氧化还原酶为过氧化氢酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇脱氢酶、漆酶、多酚氧化酶中的一种。进一步地，所述硝酸锌、去离子水与2-甲基咪唑的用量比为10～400mg:1～5mL:410.0mg；所述2-甲基咪唑、酰化氧化还原酶溶液与聚乙烯吡咯烷酮的用量比为410.0mg:5mL:50.0mg；溶解的温度为42℃；所述搅拌的时间为5-10min。进一步地，所述固定化氧化还原酶粉末用量为10mg，去离子水的用量为1～5mL；所述载体干燥时间为20min，滴在电极表面的载体溶液为10μL。所述的新型固定化氧化还原酶电极的制备方法制备的固定化氧化还原酶电极。与现有技术相比较，本专利技术的有益效果体现如下：MOFs-酶可以维持酶的稳定性，增强酶的生物活性，提高酶负载率。与其它酶固定化方式相比，本专利技术首先选用了MOFs材料的单体小分子修饰氧化还原酶，定向改善氧化还原酶的酶学性质，然后在原位常温下水相制备固定化酶的过程中，将带单体的修饰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型固定化氧化还原酶电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)对氧化还原酶进行修饰：/n将卤代羧酸溶于乙腈中，加入咪唑类化合物，第一次磁力搅拌反应，将得到的反应产物用无水乙醚萃取，得到下层油状物质，真空干燥，得到羧酸甲基咪唑修饰剂；将羧酸甲基咪唑修饰剂与羰基二咪唑混合，加入到无水二甲亚砜中，第二次磁力搅拌，室温反应，得到活性体；将活性体加入到氧化还原酶液中，第三次磁力搅拌反应，透析，得到酰化氧化还原酶溶液；/n(2)制备固定化氧化还原酶：/n将硝酸锌加入到去离子水中，得到溶液A；将2-甲基咪唑、酰化氧化还原酶溶液与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解于去离子水中，得到溶液B；将溶液A与溶液B混合，搅拌，离心、洗涤，冻干得到固定化氧化还原酶粉末；/n(3)氧化还原酶电极的制备：/n称取固定化氧化还原酶粉末溶解在去离子水中，超声处理后得载体溶液，用移液管将载体溶液滴在电极表面，在红外灯照射下干燥电极，待电极表面干燥后得到氧化还原酶电极。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型固定化氧化还原酶电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对氧化还原酶进行修饰：
将卤代羧酸溶于乙腈中，加入咪唑类化合物，第一次磁力搅拌反应，将得到的反应产物用无水乙醚萃取，得到下层油状物质，真空干燥，得到羧酸甲基咪唑修饰剂；将羧酸甲基咪唑修饰剂与羰基二咪唑混合，加入到无水二甲亚砜中，第二次磁力搅拌，室温反应，得到活性体；将活性体加入到氧化还原酶液中，第三次磁力搅拌反应，透析，得到酰化氧化还原酶溶液；
(2)制备固定化氧化还原酶：
将硝酸锌加入到去离子水中，得到溶液A；将2-甲基咪唑、酰化氧化还原酶溶液与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解于去离子水中，得到溶液B；将溶液A与溶液B混合，搅拌，离心、洗涤，冻干得到固定化氧化还原酶粉末；
(3)氧化还原酶电极的制备：
称取固定化氧化还原酶粉末溶解在去离子水中，超声处理后得载体溶液，用移液管将载体溶液滴在电极表面，在红外灯照射下干燥电极，待电极表面干燥后得到氧化还原酶电极。


2.根据权利要求1所述的新型固定化氧化还原酶电极的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述卤代羧酸为氯乙酸或溴丙酸；所述咪唑类化合物为1,2-二甲基咪唑或1-丁基-2-甲基咪唑。


3.根据权利要求1所述的新型固定化氧化还原酶电极的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述卤代羧酸与咪唑类化合物的摩尔比为2:1～10:1。


4.根据权利要求1所述的新型固定化氧化还原酶电极的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一次磁力搅拌反应的温度为60...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹彬，王鹏云，夏姣姣，张黎明，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32