用于完整和片段化的标志物的方法技术

本文所述的发明专利技术涉及通过如下分离样品中的分析物的所有变型的方法：使变型与具有附接的分析标记物的颗粒结合，和从所述样品分离所述颗粒，随后从颗粒移取分析标记物和通过测量分析标记物来测量分析物分子。颗粒上分离的分析标记物然后能够用于测量结合变型的分析物的变型。

Methods for complete and fragmented markers

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于完整和片段化的标志物的方法本申请根据35U.S.C.第119节要求2017年4月1日提交的题为“MethodForCompleteAndFragmentedMarkers”的美国临时专利申请号62/480,370的优先权益处；并且其以其整体通过引用并入本文。背景本专利技术涉及用于相对于非稀有分子富集和检测稀有分子的方法。在一些方面，本专利技术涉及用于检测怀疑含有稀有分子和非稀有分子的一种或多种不同群体的样品中的稀有分子的一种或多种不同群体的方法、设备和试剂盒。在一些方面，本专利技术涉及用于检测在样品中自由循环的稀有分子的一种或多种不同群体的方法和试剂盒。在其他方面，本专利技术涉及用于检测怀疑含有稀有细胞和非稀有细胞的一种或多种不同群体的样品中的与稀有细胞缔合的稀有分子的一种或多种不同群体的方法和试剂盒。1至50,000个拷贝/10µL(飞摩尔(fM)或更少)范围内的稀有分子的检测不能通过常规亲和力测定法实现，所述常规亲和力测定法需要远高于对于稀有分子发现的那些的分子拷贝数。例如，免疫测定法通常不能实现1皮摩尔(pM)或更小的检测限值。免疫测定法受抗体的亲和力结合常数的限制，所述亲和力结合常数通常不高于10-12(1pM)。免疫测定法需要至少100倍抗体过量，因为解离速率通常为10-13，并且样品中的所有分析物的完全结合都受抗体溶解度的限制。抗体溶解度的该相同问题阻止常规免疫测定法达到亚阿托摩尔检测水平。细胞结合或包含在细胞内的稀有分子的检测在医学应用中、诸如在诊断可以从单一细胞传播的疾病中也是重要的。含有稀有和非稀有分子的混合物的样品使循环稀有分子的检测复杂化。所述材料可以是细胞的，例如在细胞内部或“无细胞”材料，并且不与任何完整细胞结合或缔合。无细胞稀有分子在医学应用、诸如例如诊断组织中的癌症中是重要的。在癌症的情况下，稀有分子从组织脱落进入循环，并且应理解，无细胞稀有分子与分布在全身的患病组织(例如肿瘤)中的稀有分子的总量相关。无细胞分析需要从样品中的所有分子的非常小级分分离并检测循环的稀有分子。当无细胞分子从组织中的患病细胞脱落至外周血中时，这些分子与从健康细胞脱落的分子混合。例如，在1cm3的患病组织中存在近似109个细胞。如果该组织块完全溶解至5L血液(成人的平均血液体积)中，则这将仅为200万个细胞/10mL血液，并且被认为是稀有的，考虑到每10mL血液存在平均7500万个白细胞和500亿个红细胞(其各自释放非稀有分子)。当期望测量相应的蛋白和肽时，样品中的肽和蛋白变型的复杂性引起重大问题。在利用抗体用于肽和蛋白分离的研究中，已使用SELDI亲和质谱方法表明变型的这些问题(Pugia,GlycoconjJ2007)。已知肽和蛋白在酶的作用下片段化并在生物系统中经历翻译后修饰。例如，由于检测到数百种不同形式的片段化和糖-缀合，在不同患者的生物样品中检测到高度尿胰蛋白酶抑制剂的变型。检测到的形式取决于患者、疾病、样品类型和用于分离的亲和剂。独特的亲和剂对其他蛋白表现出不同的交叉反应性。这种变型引起分析的问题。例如，源自相同肽或蛋白的单独、独特片段的测量经常产生不同的结果。需要确定哪些片段的重要性更高或更低，可能需要相似片段的求和，并且用于方法的亲和试剂对某些片段的反应性更高或更低。肽和蛋白的变型随着这些变体变得被其他生物分子结合而增加，所述其他生物分子可以改变变体的功能。肽和蛋白的高度变型变为一个问题，因为免疫测定方法经常必须能够独立地检测每种变体。夹心免疫测定法通常用于特异性测量分析物的独特片段或形式，并且依赖于通过结合两个分开的位置来测量变型。夹心免疫测定法需要足够的空间用于两种单独的抗体结合相同片段；然而，由于这些片段含有与那些其他变体相同的肽或蛋白区域，因此区域经常不适合与抗体结合用于特定测定。其他生物分子的额外结合可以阻断抗体或引起交叉反应性。半胱氨酸可以形成二硫键，并且其他二级分子可以结合片段或被切割并改变抗体结合，仅举通过免疫测定法测量具有高度的变型的肽和蛋白中的一些问题。多重化是免疫测定方法的另一个问题，因为大多数方法使用光学检测标记物-无论是化学发光的，荧光的还是比色的–其提供有限数目的可分辨信号，用于在相同分析内同时测量。由于该原因，数百至数千种变型的分析是光学系统的问题。这些方法需要在多重化的组和阵列中进行多个、单独的测量，这增加成本和复杂性。解决高度的变型的问题的常见替代方法是通过使用待测量的肽或蛋白作为酶、蛋白酶和肽酶的作用的底物。这些测量基于观察到的蛋白酶活性，并且可用于测量酶、蛋白酶、肽酶及其抑制剂。例如，这些方法已用于分析胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶(弹性蛋白酶、组织蛋白酶、类胰蛋白酶、胰蛋白酶、激肽释放酶、凝血酶、纤溶酶和因子VII和X)及其抑制剂(双库尼茨抑制剂、乌司他丁和尿胰蛋白酶抑制剂)(CoreyUS6955921)。在这些情况下，该肽用作底物，在氨基酸切割位点处附接至发色团。在被蛋白酶切割后，片段被释放并被活化以生成颜色。当添加已知量的蛋白酶时，测量抑制剂的浓度。在这里，抑制剂的量与释放的底物的量成反比，因为抑制剂降低蛋白酶的活性。然而，发色团对干扰敏感，其中样品pH、氧化剂、还原剂或反应物逆转或过早生成颜色。质谱法测量肽或蛋白底物的用途已用于消除与发色团相关的问题。例如，已经针对肾素-血管紧张素-醛固酮系统显示这一点。在该系统中，血管紧张素原I(AngI)(DRVYIHPFHL)通过肾素的酶促切割中的两个C-末端氨基酸的切割转化为AngII(DRVYIHPF)(Popp2014)。AngI的测量允许通过利用固定至亲和珠的抗AngI抗体以同时捕获来自血浆的内源性AngI连同稳定的同位素标记的AngI来进行血浆肾素活性测定。将血浆样品分开并在37℃下孵育3h或在冰上孵育。确定两种血浆孵育条件的AngI浓度的差异，允许计算患者的血浆肾素活性。该酶、蛋白酶和肽酶测定法仍然对干扰敏感，其中样品pH、样品稳定性、抑制剂、辅因子、时间和温度抑制或活化活性。质谱法(MS)是一种极端灵敏和特异性的技术，其非常良好地适合用于检测低至pM浓度的小分子且样品消耗量少(1微升(µL)或更少)。MS还具有在单一测定中同时测量复杂生物介质中存在的数百种组分(多重化)而无需标记试剂的能力。该方法提供了特异性和灵敏度，直至生物学复杂性引起信号重叠(同重元素干扰)或导致离子抑制。MS与预分离步骤(诸如液相色谱法(LC-MS))的联用是增加灵敏度和限制同重元素干扰并克服高丰度非分析物样品组分的离子抑制的广泛使用的方法；然而，这大大增加分析运行时间、成本和样品制备复杂性。串联MS(MS/MS)可用于在高背景干扰的情况下增加信噪比并区分同重元素分析物(共有相同的母体质荷比(m/z))，但表现出质谱仪内的独特片段化；然而，MS/MS数据的分析不是简单的任务，尤其是在翻译后修饰的蛋白和肽的情况下，并且仍然受到离子抑制的影响，尤其是在片段离子化差的情况下。使用飞行时间质谱仪的基质辅助的激光解吸/离子化(MALDI-TOF)非常适合于低丰度分子的高灵敏度分析；然而，样品复杂性和基质干扰频繁导致同重元素干扰。M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离和测量分析物样品中的变型的方法，所述方法包括：/n(a)使具有变型的所述分析物样品与具有附接的分析标记物的颗粒结合；/n(b)从所述样品分离所得的颗粒，/n(c)从所述颗粒移取所述分析标记物；和/n(d)通过测量分析标记物来测量分析物分子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170401 US 62/480370;20180331 US 15/9425241.分离和测量分析物样品中的变型的方法，所述方法包括：
(a)使具有变型的所述分析物样品与具有附接的分析标记物的颗粒结合；
(b)从所述样品分离所得的颗粒，
(c)从所述颗粒移取所述分析标记物；和
(d)通过测量分析标记物来测量分析物分子。


2.权利要求1的方法，其中所述分析标记物通过X-Y键附接至所述颗粒，并且通过断裂所述X-Y键而释放。


3.权利要求1的方法，其中所述分析物的变型通过一种或多种亲和剂与所述颗粒结合。


4.权利要求1的方法，其中所述亲和剂通过X-Y键附接并通过断裂X-Y键而释放。


5.权利要求2的方法，其中用于附接所述分析标记物的X-Y键是硫化物、醚、酯、硫酯、酰胺、缩酮、硫代酰胺、N-氧化物、氮-氮或硫醚。


6.权利要求4的方法，其中用于附接所述亲和剂的X-Y键是硫化物、醚、酯、硫酯、酰胺、缩酮、硫代酰胺、N-氧化物、氮-氮或硫醚。


7.权利要求2的方法，其中X-Y选自S、O、C、P、N、B、Si、Ni、Pd、FeCo、Ag、Cu或Au。


8.权利要求4的方法，其中X-Y选自S、O、C、P、N、B、Si、Ni、Pd、FeCo、Ag、Cu或Au。


9.权利要求2的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：MJ蒲吉亚，Z贝尔德，Z曹，
申请(专利权)人：印第安纳州生物科技研究所公司，
类型：发明
国别省市：美国;US