一种激活肿瘤免疫的基因修饰干细胞制备方法技术

本发明专利技术提供了一种激活肿瘤免疫的间充质干细胞及其应用，属于生物医药领域。本发明专利技术通过采用基因工程手段使间充质干细胞表达抗OX

【技术实现步骤摘要】
一种激活肿瘤免疫的基因修饰干细胞制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种激活肿瘤免疫的基因修饰干细胞制备方法。

技术介绍

[0002]肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。恶性肿瘤可分为癌和肉瘤，癌是指来源于上皮组织的恶性肿瘤。肉瘤是指间叶组织，包括纤维结缔组织、脂肪、肌肉、脉管、骨和软骨组织等，发生的恶性肿瘤。研究发现，肿瘤细胞会出现不同于正常细胞的代谢变化，同时肿瘤细胞自身可通过糖酵解和氧化磷酸化之间的转换来适应代谢环境的改变。针对T细胞表面的免疫检查点开发抗体一直是肿瘤免疫治疗的热点之一，但是除了CTLA
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4、PD
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1这类细胞表面抑制性受体之外，T细胞表面还有一类激活性受体分子，同样在机体的免疫应答中具有重要作用，OX40就是其中之一。
[0003]OX40(又称CD134、TNFRSF4、ACT35)属肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)，是分子量约50kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白，共含有277个氨基酸(胞浆49个氨基酸、胞外186个氨基酸)。OX40是一个相对保守的分子，其胞外段的配体结合区主要由三个完整的半胱氨酸富集区CRD1、CRD2、CRD3和一个不完整的半胱氨酸富集区CRD4组成。
[0004]在体内，OX40主要是在活化的CD4
+
T、CD8
+
T细胞表面诱导性表达，而初始T细胞及未致敏的记忆T细胞都不表达OX40。此外，OX40还表达于调节T细胞、NK细胞、NKT细胞和中性粒细胞。TCR信号可以诱导OX40表达，但其在T细胞表面的高表达仍需要额外的共刺激信号和相关细胞因子的协助，例如CD28
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B7.1/2、IL
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2和TNF等。T细胞在抗原刺激24小时后开始表达OX40，并在48
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72小时后表达量达到峰值。OX40的表达时长取决于TCR信号及相关的共刺激信号的强弱，通常持续5
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6天。OX40在记忆T细胞上的表达要比效应T细胞迅速的多，通常在激活后1
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4小时内。在体外培养的细胞系中，仅有少数细胞系能够表达OX40，且全部都是HTLV
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1感染的人T淋巴细胞，其中绝大部分是CD4
+
T细胞，例如，Hut
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102、MT
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2、ATL
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43T和PHA刺激的PBMC，未刺激的PBMC则不能表达。除上述细胞外，目前暂未发现其他细胞能够表达OX40。
[0005]专利CN201880050094.X公开了用于癌症治疗的Treg消耗性抗体分子，如Treg消耗性抗4
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1BB抗体或Treg消耗性OX
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40抗体，可特异性结合属于肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的靶标。专利CN201910303942.X则公开了一种重组的抗OX40(CD134)抗体及其用途，所述抗体能够与哺乳动物OX40特异性结合，优选地具有对人和/或灵长类动物OX40蛋白的高亲和性、在一定浓度下可刺激T细胞的活化及增殖等效果。
[0006]使用OX40激动剂抗体增强OX40信号可通过激活增强T细胞介导的抗肿瘤免疫，增强效应种属特异性T细胞免疫应答，增强细胞因子IL
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2、IL
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5和IFN
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g的产生，并增强抗原激发后肿瘤特异性记忆T细胞的生成，有助于肿瘤消退和延长生存期，OX40激动剂可能增加T
细胞浸润肿瘤，并增强常规CD4和CD8T细胞的抗肿瘤免疫应答，从而改善几种临床前癌症模型的生存率，包括B16黑色素瘤、Lewis肺癌、结肠癌、乳腺癌和4T
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1乳腺癌。因此，OX40/OX40L通路激动剂能被用于癌症免疫治疗。然而治疗性单克隆抗体药物虽然具有先进的抗癌功能，但是抗体的免疫原性、肿瘤靶点长期使用的耐受性以及单纯性阻断信号转导通路的长期效果等问题仍有待进一步研究，多数单抗很难实现对肿瘤细胞的长期有效抑制和杀伤作用。
[0007]基于此，亟需一种新的方法解决上述单抗的不足，用于制备激活肿瘤免疫的药物。

技术实现思路

[0008]针对上述不足，本专利技术提供了一种激活肿瘤免疫的间充质干细胞及其应用。本专利技术通过采用基因工程手段使间充质干细胞表达OX
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40单抗融合蛋白，可增强效应T细胞的活化和增殖，特异性结合高OX
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40表达的Treg细胞，从而抑制肿瘤细胞免疫逃逸，达到治疗肿瘤相关疾病的目的。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0010]一方面，本专利技术提供了一种抗OX
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40单克隆抗体融合蛋白(以下简称“OX
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40单抗融合蛋白”或“融合蛋白”)的编码核苷酸，所述的编码核苷酸包含编码OX
‑
40抗体的核苷酸。
[0011]具体地，所述的编码OX
‑
40抗体的核苷酸包含编码OX
‑
40抗体轻链可变区VL的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、和编码OX
‑
40抗体重链可变区VH的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
[0012]所述的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为：
[0013]GACATCCAAATGACTCAGAGTCCAAGTTCTTTGTCCGCCTCAGTTGGCGACAGAGTAACGATCACTTGCAGAGCCAGCCAAGATATCAGTAACTACTTGAATTGGTACCAACAGAAACCTGGGAAGGCACCGAAACTTCTGATCTACTACACATCTAAACTTCATTCAGGCGTCCCTTCACGCTTCTCTGGTTCCGGCTCTGGAACTGACTACACACTGACAATTTCAAGTCTCCAGCCCGAAGATTTTGCAACATATTATTGTCAACAGGGCTCCGCGCTCCCATGGACGTTTGGACAAGGAACGAAGGTAGAAATCAAG；
[0014]所述的SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为：
[0015]CAAGTTCAACTTCAGGAATCAGGTCCCGGCTTGGTTAAGCCTTCACAGACACTCTCCCTGACTTGTGCAGTGTATGGCGGTTCTTTTAGTAGTGGGTATTGGAATTGGATAAGGAAGCATCCAGGAAAAGGTCTTGAGTACATCGGGTATATCAGTTACAATGGGATCACCTATCACAACCCGAGCCTGAAGTCCCGAAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗OX
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40单克隆抗体融合蛋白的编码核苷酸，其特征在于：所述的编码核苷酸包含编码OX
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40抗体的核苷酸；所述的编码OX
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40抗体的核苷酸包含编码OX
‑
40抗体轻链可变区VL的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、和编码OX
‑
40抗体重链可变区VH的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为：GACATCCAAATGACTCAGAGTCCAAGTTCTTTGTCCGCCTCAGTTGGCGACAGAGTAACGATCACTTGCAGAGCCAGCCAAGATATCAGTAACTACTTGAATTGGTACCAACAGAAACCTGGGAAGGCACCGAAACTTCTGATCTACTACACATCTAAACTTCATTCAGGCGTCCCTTCACGCTTCTCTGGTTCCGGCTCTGGAACTGACTACACACTGACAATTTCAAGTCTCCAGCCCGAAGATTTTGCAACATATTATTGTCAACAGGGCTCCGCGCTCCCATGGACGTTTGGACAAGGAACGAAGGTAGAAATCAAG；所述的SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为：CAAGTTCAACTTCAGGAATCAGGTCCCGGCTTGGTTAAGCCTTCACAGACACTCTCCCTGACTTGTGCAGTGTATGGCGGTTCTTTTAGTAGTGGGTATTGGAATTGGATAAGGAAGCATCCAGGAAAAGGTCTTGAGTACATCGGGTATATCAGTTACAATGGGATCACCTATCACAACCCGAGCCTGAAGTCCCGAATAACTATTAACAGGGACACCTCTAAAAACCAGTATAGCCTTCAATTGAATAGTGTTACGCCAGAGGATACTGCTGTGTACTACTGTGCTAGATACAAATACGACTATGATGGAGGACATGCGATGGACTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTGACCGTCTCCTCC；所述的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为：GACATACAAATGACCCAGAGTCCTAGCTCACTATCGGCGTCTGTCGGTGACCGGGTGACCATCACATGTCGAGCCTCGCAGGACATATCGAACTACCTTAACTGGTACCAGCAGAAACCTGGGAAAGCACCAAAGCTTTTAATCTACTATACTTCGAAGCTTCATTCTGGTGTCCCATCGCGTTTCAGCGGATCTGGTTCCGGGACAGACTACACCCTGACCATATCAAGCCTGCAACCCGAAGATTTTGCGACTTACTACTGCCAACAGGGATCAGCTCTTCCATGGACGTTCGGGCAAGGCACAAAGGTCGAGATTAAA；所述的SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为：CAGGTCCAATTGCAGGAGTCAGGACCTGGGCTCGTCAAGCCGTCACAGACTTTATCTTTGACATGCGCAGTGTATGGGGGATCGTTCTCAAGCGGTTACTGGAACTGGATTAGAAAGCATCCGGGGAAGGGGCTAGAGTACATTGGGTATATCTCGTATAAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘广洋，刘拥军，李欣，张晨亮，徐立强，陈瑶瑶，
申请(专利权)人：北京贝来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：