一种用于检测活细胞中mTORC1活性的遗传编码荧光生物传感器及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测活细胞中mTORC1活性的遗传编码荧光生物传感器及其构建方法，其包括：融合体基因结构A、融合体基因结构B、用于连接融合体基因结构A和融合体基因结构B的连接部。融合体基因结构A是由mTORC1磷酸化底物的编码基因、标记蛋白基因和寡聚化标签基因组成的融合基因；融合体基因结构B是由所述mTORC1磷酸化底物的结合蛋白编码基因和寡聚化标签基因组成的融合基因；连接部为自剪切多肽的编码基因。该传感器可对抑制态mTORC1进行快速有效地活细胞检测，并可广泛用于mTORC1活性抑制剂及调控基因的筛选。mTORC1活性抑制剂及调控基因的筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测活细胞中mTORC1活性的遗传编码荧光生物传感器及其构建方法


[0001]本专利技术属于生物传感器领域，具体涉及一种用于检测活细胞中mTORC1活性的遗传编码荧光生物传感器及其构建方法。

技术介绍

[0002]哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是真核生物中一种关键的代谢调节激酶，具有丝氨酸和苏氨酸激酶活性(Ser/Thr kinase)。mTOR通过整合营养物质、生长因子和能量代谢等细胞内外信号参与基因转录、蛋白质翻译和核糖体合成等多种生物学功能调控，从而进一步调节细胞的代谢生长、凋亡和自噬等核心生理过程，因此，也被称为细胞的“大脑”。mTOR及其介导的信号通路紊乱与人类代谢、寿命、癌症及癫痫等重大疾病的形成和发展密切相关。
[0003]介导mTOR生物学效应的分子分两种：一种是哺乳动物雷帕霉素靶标蛋白复合物1(The mammalian Target of Rapamycin complex 1，mTORC1)，另一种是哺乳动物雷帕霉素靶标蛋白复合物2(mTORC2)。关于mTORC1信号的生理病理研究相对广泛，mTORC1复合物包含激酶mTOR和调控蛋白RICTOR及支架蛋白mLST8等功能，因此，mTORC1活性的变化是相关疾病生理病理变化的重要判断依据。
[0004]相关技术中，大多数mTORC1检测技术主要是利用特异性抗体通过蛋白印迹和免疫组织化学手段检测体外提取蛋白或固定组织细胞中mTORC1底物磷酸化水平(如磷酸化S6K或磷酸化4EBP1)来判断mTORC1的活性，但普遍存在检测耗时长、无法实现高通量快速检测、检测成本高、受制于抗体特异性或对于检测人员的操作要求高等问题。
[0005]因此，开发一种能够克服上述缺点，并可以实现在活细胞中通过荧光显微镜快速、有效、实时检测mTORC1活性的检测方法及生物传感器，对于细胞水平上的高通量mTORC1抑制药物或调控物的筛选和鉴定具有极为重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种用于检测活细胞中mTORC1活性的遗传编码荧光生物传感器及其构建方法，该传感器可以作为检测活细胞mTORC1活性的传感器，其在mTORC1失活条件下从弥散态形成聚集点是其响应mTORC1活性的显著特征，从而可进一步用于mTORC1抑制剂的筛选以及mTORC1活性调控基因的筛查。
[0007]本专利技术的第一个方面，提供一种生物传感器，该生物传感器包括：
[0008]融合体基因结构A、融合体基因结构B、用于连接融合体基因结构A和融合体基因结构B的连接部；
[0009]所述融合体基因结构A是由mTORC1磷酸化底物的编码基因、标记蛋白基因和寡聚化标签基因组成的融合基因；
[0010]所述融合体基因结构B是由所述mTORC1磷酸化底物的结合蛋白编码基因和寡聚化标签基因组成的融合基因；
[0011]所述连接部为自剪切多肽的编码基因。
[0012]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述mTORC1磷酸化底物为4EBP1。
[0013]4EBP1(真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1)是mTOR的下游分子之一，主要其调控蛋白质的翻译功能。Gene ID：1978(人源)或13685(人源)。
[0014]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述mTORC1磷酸化底物的结合蛋白为EIF4E。
[0015]EIF4E(真核翻译起始因子4E)是一种蛋白质编码基因，可别信使RNA 5'末端的7
‑
甲基鸟苷帽结构。Gene ID：1977(人源)或13684(人源)。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所用的4EBP1和EIF4E可采用任意物种来源的的4EBP1和EIF4E。在本专利技术的一些优选实施方式中，所述4EBP1和EIF4E为人源或鼠源的4EBP1和EIF4E。在本专利技术的一些更优选实施方式中，所述4EBP1和EIF4E为人源4EBP1和EIF4E。
[0017]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述寡聚化标签包括六聚体标签(HoTag3)、四聚体标签(HoTag6)中的至少一种。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理使用其他的寡聚化蛋白标签进行替代，如HoTag2、HoTag7等。
[0018]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述标记蛋白基因包括荧光蛋白。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述荧光蛋白为单体荧光蛋白。所述单体荧光蛋白包括但不限于AcGFP、mNG、mBFP和mCherry。
[0020]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述自剪切多肽包括任意具有“自我剪切”的多肽(P2A)，包括但不限于T2A、E2A和F2A。或使用内部核糖体进入位点序列(IRES)来替代，从而实现能使一个表达载体表达一条转录本，产生多种蛋白的功能。
[0021]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述生物传感器具体由3部分组成：融合体基因结构A、融合体基因结构B和用于连接结构A和结构B的连接部。其中，融合体基因结构A是由4EBP1编码基因、单体荧光蛋白编码基因mFP和六聚体标签基因HOTag3组成的融合基因。融合体基因结构B是由4EBP1结合蛋白EIF4E基因和四聚体标签基因HOTag6组成的融合基因。连接部为自剪切多肽P2A序列的编码基因。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述生物传感器的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0023]本专利技术中的生物传感器经试验验证，可在活细胞中通过荧光显微镜快速、有效、实时检测mTORC1活性受抑制的情况，并将其应用于细胞水平较高通量mTORC1抑制药物或调控物的筛选和鉴定。
[0024]在相关技术中，基于活细胞激酶活性的遗传编码报告系统仅存在TORCAR和AIMTOR系统，但上述两种系统中存在信噪比低等诸多缺陷，因此，专利技术人基于上述生物传感器开发得到活细胞遗传编码的mTORC1活性报告系统(也可称mTORC1失活报告系统，mTOR inactive reporter，mTIR)。其作为一种荧光生物传感器用于mTORC1在活细胞内的实时活性检测，可应用于细胞水平高通量mTORC1信号调控物和相关疾病先导化合物的筛选和鉴定，是目前首个可应用于高通量活细胞mTORC1活性抑制药物筛选的生物传感器。
[0025]本专利技术的第二个方面，提供编码本专利技术第一个方面所述生物传感器的核酸分子。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，所述生物传感器为具有红色荧光的mTIR传感器，其红色荧光来自其中的荧光蛋白mCherry编码基因。
[0028]所述生物传感器的检测原理为：将该mTI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括：融合体基因结构A、融合体基因结构B、用于连接融合体基因结构A和融合体基因结构B的连接部；所述融合体基因结构A是由mTORC1磷酸化底物的编码基因、标记蛋白基因和寡聚化标签基因组成的融合基因；所述融合体基因结构B是由所述mTORC1磷酸化底物的结合蛋白编码基因和寡聚化标签基因组成的融合基因；所述连接部为自剪切多肽的编码基因。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述mTORC1磷酸化底物为4EBP1，所述mTORC1磷酸化底物的结合蛋白为EIF4E。3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述寡聚化标签包括六聚体标签、四聚体标签中的至少一种。4.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述标记蛋白基因包括荧光蛋白；所述荧光蛋白优选为单体荧光蛋白。5.根据权利要求1～4任一项所述的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢小多，欧阳颖仪，李灿荣，陆楚欣，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：