环状RNA分子及其在目标蛋白的靶向降解中的应用制造技术

本公开属于生物医药领域，具体来说，本公开涉及一种环状RNA分子、环化前体RNA分子、重组核酸分子、重组表达载体、重组宿主细胞、组合物及其在目标蛋白的靶向降解中的应用，以及一种预防或治疗疾病的方法。环状RNA分子具有良好的透膜性，易于向胞内递送，具有高效的体内蛋白靶向降解活性。本公开的环状RNA分子成功实现了对肿瘤生长抑制，首次证明了bio

【技术实现步骤摘要】
环状RNA分子及其在目标蛋白的靶向降解中的应用


[0001]本公开属于生物医药领域，具体来说，本公开涉及一种环状RNA分子、环化前体RNA分子、重组核酸分子、重组表达载体、重组宿主细胞、组合物及其在目标蛋白的靶向降解中的应用，以及一种预防或治疗疾病的方法。

技术介绍

[0002]细胞中的蛋白质不断处于合成、修饰与降解的代谢更新过程中，保持正常的蛋白质代谢对于生命的正常功能至关重要。对特定蛋白的降解或干预是研究蛋白质功能的重要途径，也是用于治疗由蛋白异常表达引起的相关疾病的重要措施。目前，对致病蛋白的降解或干预已经成为最有效的疾病治疗策略之一。
[0003]传统的小分子抑制剂通过结合目标蛋白(Protein of interest，POI)的活性位点来影响致病蛋白的生物学功能，从而达到治疗效果，至今已被成功用于癌症等多种疾病的临床治疗中。然而，传统小分子药物的研发策略决定其无法作用于“无成药性”(Undruggable)的靶点蛋白，导致目前细胞内仅有20％左右的蛋白可以作为靶点被应用于小分子药物的临床研究中。与此同时，基因编辑技术(例如，CRISPR/Cas技术)、RNAi技术都在一定程度上下调了目标蛋白的表达。然而，这些方法的缺点是需要很长时间才能有效地消除蛋白表达，并且，也无法作用于翻译后修饰的蛋白。一旦目标蛋白的翻译停止，蛋白质的消耗完全取决于其固有的半衰期。因此，CRISPR/Cas技术、RNAi技术等方法对于目标蛋白的调控存在很大的应用局限性
[1]。
[0004]细胞中的蛋白质稳态主要依赖细胞内固有的蛋白质降解途径的协调运作维持，其中自噬
‑
溶酶体途径(autophagy
‑
lysosome pathway)和泛素
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蛋白酶体途径(ubiquitin
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proteasome pathway，UPP)在蛋白质降解中发挥着重要的生物学功能。
[0005]蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)技术是近年来发展起来的一种有效的内源性蛋白质降解工具
[2
‑
3]，主要由三部分组成：1)E3连接酶配体，主要用于招募E3连接酶；2)靶标蛋白配体，可以与靶标蛋白(protein of interest，POI)相结合；3)linker，连接E3连接酶配体和靶标蛋白配体。当PROTAC进入细胞后，其一端的靶标蛋白配体特异性识别靶标蛋白并与之结合，另一端的E3连接酶配体与E3结合，从而形成POI
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PROTAC
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E3ligase三元复合物。PROTAC复合物可以将E3连接酶连接到靶标蛋白上，并招募泛素化的E2，最终将靶标蛋白进行泛素化降解。传统的PROTACs蛋白降解剂主要是小分子化合物。小分子PROTACs蛋白降解剂的出现为解决不可成药靶点提供了可能，因此也成为药物研发的热点领域。然而，小分子PROTACs的药物研发也具有显著缺点，例如其分子量与传统小分子药物相比较大，因此不容易穿透细胞膜，难以进入细胞产生作用；小分子PROTACs依赖细胞内现存的E3泛素连接酶，如果后者表达量较低，则难以产生预期效果。
[0006]近年以来开发出来的抗体或多肽介导的蛋白质降解技术，称为生物
‑
蛋白降解靶向嵌合体技术(Bio
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PROTAC)能克服以上小分子PROTACs的缺点。TRIM21是一种E3泛素连接酶，与抗体的Fc结构域具有高亲和力
[4]，在多种细胞类型和组织中广泛表达
[5]。TRIM21可以
识别抗体结合的病原体并招募泛素
‑
蛋白酶体系统对其进行降解
[6]。利用TRIM21的特性，将抗体与PROTAC技术相结合产生的降解内源性蛋白的技术称为Trim
‑
Away
[7]。在Trim
‑
Away系统中，抗体即相当于PROTAC技术的三连体结构，将抗体通过电转等形式进入细胞后可以结合特定的靶标蛋白，然后Fc端结合TRIM21，抗体，靶标蛋白和TRIM21三元复合物被泛素化并最终被蛋白酶降解。完成蛋白降解需要三个步骤：1)引入可与靶标蛋白相结合的抗体；2)将内源或外源的TRIM21募集至靶标蛋白；3)招募泛素化的E2，促使蛋白酶体介导的蛋白复合物降解。该方法可以快速降解细胞中的靶标蛋白，因此避免了因为长时间筛选而形成的补偿路径。相较于传统的DNA和RNA水平的基因干扰技术，Trim
‑
Away技术可以对已经产生的蛋白尤其是长寿命的蛋白实现更好的降解效果；另外，Trim
‑
Away技术对胞质和核内的蛋白都可实现降解。此外，也有研究报道通过构建纳米抗体
‑
RNF4 E3泛素连接酶的RING结构域嵌合蛋白实现靶蛋白降解
[8]；以及其他分别采用单链抗体、Darpins、纳米抗体、多肽等手段靶向目的蛋白，并分别与不同的E3连接酶组成嵌合蛋白起到蛋白降解作用。然而，无论Trim
‑
Away还是其他各种重组蛋白形式的Bio
‑
PROTAC，均面临重大的临床应用难题，即需要将该重组蛋白形式的蛋白降解剂递送至特定的细胞内才能发挥作用。Bio
‑
PROTAC的分子量大、透膜性差，导致Bio
‑
PROTAC难以进入细胞内发挥作用。对于体外培养的细胞系，尚能采用电转化的方式实现递送重组蛋白的胞内递送。然而，对于Bio
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PROTAC分子的体内递送尚未有合适的技术手段。因此，Bio
‑
PROTAC的体内应用实例目前尚未见报道。
[0007]引用文献：
[0008][1]Toyama,B.H.,Savas,J.N.,Park,S.K.,Harris,M.S.,Ingolia,N.T.,Yates,J.R.,3rd,and Hetzer,M.W.(2013).Identification of long
‑
lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.Cell 154,971
–
982.
[0009][2]Sakamoto KM,Kim KB,Verma R,Ransick A,Stein B,Crews CM,Deshaies RJ.Development of Protacs to target cancer
‑
promoting proteins for ubiquitination and degradation.Mol Cell Proteomics.2003 Dec；2(12):1350
‑
8.
[0010][3]Burslem GM,Crews CM.Proteolysis
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子编码具有目标效应活性的重组多肽，所述目标效应活性为目标蛋白的靶向降解活性。2.根据权利要求1所述的环状RNA分子，其中，所述重组多肽包括靶向结合所述目标蛋白的第一多肽，和与所述第一多肽融合的第二多肽，所述第二多肽具有E3泛素连接酶的酶活性；可选地，所述重组多肽还包含连接所述第一多肽与所述第二多肽的连接肽。3.根据权利要求1或2所述的环状RNA分子，其中，所述目标蛋白为跨膜蛋白或细胞内蛋白；优选地，所述目标蛋白为疾病相关蛋白；可选地，所述疾病相关蛋白为肿瘤相关蛋白。4.根据权利要求2或3所述的环状RNA分子，其中，所述第一多肽为靶向结合所述目标蛋白的抗体、抗体片段或抗原结合多肽。5.根据权利要求2
‑
4任一项所述的环状RNA分子，其中，所述第二多肽选自E3泛素连接酶或其功能片段；可选地，所述E3泛素连接酶的功能片段包含如下的任一种：HECT结构域、RING结构域或U
‑
box结构域。6.根据权利要求2
‑
5任一项所述的环状RNA分子，其中，所述第二多肽选自CRBN、VHL、MDM2、cIAP、βTrCP、FBW7、SPOP、SKP2、DDB2、SOCS2、ASB1、CHIP或上述任一种的功能片段。7.根据权利要求1
‑
6任一项所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子包括编码所述重组多肽的编码区序列，和与所述编码区序列可操作地连接的IRES序列。8.根据权利要求7所述的环状RNA分子，其中，环状RNA分子还包括如下的一种或两种以上的序列：第二外显子序列、第一外显子序列、5
’
间隔序列、3
’
间隔序列；优选地，所述环状RNA分子包括顺次连接的如下所示序列：第二外显子序列、5
’
间隔序列、IRES序列、编码区序列、3
’
间隔序列和第一外显子序列。9.根据权利要求1
‑
8任一项所述的环状RNA分子，其中，所述目标效应活性为受试者体内的目标蛋白的靶向降解活性；优选地，所述环状RNA分子被施用于受试者体内；可选地，所述环状RNA分子通过口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠，肿瘤体内注射、肿瘤腔内留置、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或系统性施用，优选为肿瘤体内注射。10.一种环化前体RNA分子，其中，所述环化前体RNA分子环化形成根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：左炽健，杨嘉丽，朱佳凤，杜雅冉，赵阳，孙振华，
申请(专利权)人：苏州科锐迈德生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：