【技术实现步骤摘要】
本公开属于分子生物学和生物工程，具体来说，本公开涉及一种用于制备环状rna的重组核酸分子、重组表达载体、环状rna、组合物、制备环状rna的方法、在细胞内表达目标多肽的方法、预防或治疗疾病的方法，筛选目标编码区序列的方法、用于筛选目标编码区序列的系统，以及筛选核酶识别位点序列的方法。
技术介绍
1、美国国立卫生研究院的一项临床实验观察到通过将正常的腺苷脱氨酶(ada)转移入患有ada(腺苷脱氨酶)缺乏性重度联合免疫缺陷症(ada-scid)的儿童体内，ada-scid的症状被显著改善[1-2]。这项研究极大促进了基因治疗临床研究的开展，基因治疗技术的出现有望从根本上治愈一些现有的常规疗法不能解决的疾病，弥补传统治疗方法的不足。但是，由于早期基因治疗研究中多采用逆转录病毒作为目的基因的递送载体，而逆转录病毒将目的片段通过随机插入的方式整合到目的细胞基因组上的特性决定了这种方式存在极大的不确定性以及危险性。近年来，随着病毒载体的改进(慢病毒载体，腺病毒载体，重组腺病毒相关载体等)以及非病毒载体的发展(脂质体技术，脂质纳米粒技术，微球技术，树枝状大分子技术，外泌体等)，基因治疗又再次回到人们的视线。
2、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mrna)是由dna转录而来，并为下一步蛋白质的翻译提供所需的遗传信息，在蛋白生产、作为核酸疫苗等基因治疗手段等方面具有重要的应用价值。与传统疫苗相比核酸疫苗具有免疫应答持久、制造工艺简单以及能够用于肿瘤预防等多种优势，在急性传染病、hiv和癌症预防等领域
3、虽然由核糖体内部序列(internal ribosome entry sites，ires)介导的环状rna被证明在体外通过非帽依赖(cap-independent)的方式合成蛋白[15]，但过去较长时间内，多数研究者仍然认为真核生物的核糖体在体内不能翻译环状rna(circular rna，circrna)。随着rna测序技术(rna-seq)的兴起，越来越多的环状rna被鉴定出来[3-8]，环状rna的研究得以重视。同时伴随着研究的深入，研究者发现在真核生物内，环状rna不仅广泛存在，而且表现出高度的保守特性[9]。环状rna由于其5’及3’端首尾相连形成封闭的环形，表现出相较于线性mrna对rnase更高的耐受性(resistance)；因此，相较于线性mrna，环状rna能够更长效、持久的表达[10]。另外，相较于线性mrna制备过程中繁琐的加帽、加尾以及核苷酸修饰，环状rna的生产制备表现出更加高效、快速以及成本低廉等特性。由于这些特性，虽然环状rna是一种全新的基因治疗手段，但是已经被作为一种基因治疗的载体用于商业开发。
4、rna的成环是环状rna生产加工过程中的关键步骤。目前常见的成环方法主要分为体内成环和体外成环。在真核生物体内，剪接体(spliceosome)通过两步法从未成熟的mrna上将内含子剪切下来。具体如下：首先，内含子中特定腺苷酸(branch point adenosine，bpa)上的2’-羟基将攻击5’端的剪切位点，从而在5’端的外显子末端形成3’-羟基基团；然后，新形成的3’-羟基末端在剪切体的辅助下进一步进攻3’端的剪切位点继而形成两个外显子相连的线性rna和一个套索结构(lariat)。天然的环状rna在这个过程中通过向后剪切(back-splicing)或者外显子跳跃(exon skipping)的方式产生[3,10-11]。虽然体内成环的方式可以保证成环后环状rna序列的准确性，但是需要将质粒作为治疗药物导入体内，这大大提高了向基因组内整合的风险。
5、rna的体外成环主要是依赖磷酸二酯键的形成，最常见的rna的体外成环主要分成化学法、酶催化法。其中，化学成环法中天然磷酸二酯键的形成主要通过溴化氰(cyanogenbromide)或者乙基-3-3’二甲氨基丙基碳二亚胺(ethyl-3-(3’-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)催化rna 5’-单磷酸以及3’-羟基的缩合反应成环。但是，化学法成环的连接效率低、仅适合连接小片段的环状rna[12]，并且化学基团在基因治疗过程中也存在较大的安全隐患。因此，化学成环法难以获得广泛的应用。
6、酶催化法可进一步分为蛋白酶催化以及核酶催化，其中，蛋白酶催化主要通过t4dna连接酶(t4 dna ligase)、t4 rna连接酶1(t4 rnaligase 1)、t4 rna连接酶2(t4 rnaligase 2)以及rtcb通过夹板链催化磷酸二酯键的形成[13]。但是，目前蛋白酶催化连接的方法存在对大片段环状rna的连接效率低，并且也难以得到具有精确核酸序列的环状信使核糖核苷酸。
7、核酶(ribozyme)是一种可以起到类似蛋白酶催化作用的一种rna。通过核酶在体外制备环状rna通常有三种方法，group i intron自剪切，group ii intron自剪切以及通过一些亚病毒基因组进行环化。其中group ii intron通常通过2‘5’二磷酸连接环状，这种连接方式是否会影响环状rna的表达还需要进一步的探讨。通过亚病毒的基因组连接环状rna的方式通常需要引入亚病毒基因组中的核酶，体内的一些rna通常会成为这些核酶潜在的剪切对象。group i intron催化环状核糖核苷酸成环是目前工业界常用的成环策略，其中鱼腥藻(anabaena)pie(premuted intron exon)以及t4td(thymidylate synthase oft4)pie是目前应用最为广泛的核酶催化的自剪切成环系统。在鸟嘌呤及二价阳离子存在的条件下，鱼腥藻pie以及t4td pie的内含子序列会形成特定的结构并且通过自我催化的方式剪切下来，从而将内含子中间的核糖核苷酸序列形成环状。
8、目前，环状rna在基因治疗载体、体内表达治疗性蛋白、作为核酸疫苗等领域表现在重要的应用前景，但其自身仍然存在很多尚未解决或尚未发现的问题。其中，环状rna序列的准确性是其应用于临床治疗的关键，是后续治疗效果和安全性的重要保障。研究比较了t4 ligase与t4 td pie系统、鱼腥藻pie系统连接形成环状rna对rna二级结构的影响，如图1所示，与t4 ligase连接成环的方法相比，通过t4 td pie系统、鱼腥藻pie系统自剪切成环会导致在环状rna中引入额外的外显子序列(e1、e2)，使成环后的rna结构构象发生巨大改变。并且，利用t4 td pie、鱼腥藻pie得到的环状rna，由于额外引入e1、e2序列，会引发细胞内的免疫反应，导致环状rna分子在细胞内降解[14]。
9、中国专利文献cn 112399860 a中公开了一种用于制备环状rna的载体，所述载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种环状RNA，沿5’向3’方向，其包含按如下顺序排列的元件：
2.根据权利要求1所述的环状RNA，其中，所述环状RNA的编码元件包括编码区1，和如下(i)-(ii)组成的组中的至少一种：
3.根据权利要求1所述的环状RNA，其中，所述环状RNA的编码元件包括编码区1和至少一个编码区4，并且，任意一个编码区的5’端连接有翻译起始元件。
4.根据权利要求2所述的环状RNA，其中，所述环状RNA由重组核酸分子制备，
5.根据权利要求4所述的环状RNA，其中，所述重组核酸分子包括如下(i)-(ii)中一种或两种的元件：
6.根据权利要求3所述的环状RNA，其中，所述环状RNA由重组核酸分子制备，
7.根据权利要求4-6任一项所述的环状RNA，其中，
8.根据权利要求1-7任一项所述的环状RNA，其中，所述翻译调控元件为polyAC。
9.根据权利要求7所述的环状RNA，其中，所述内含子片段I和所述内含子片段II来源于I类内含子(Group I Intron)，所述核酶识别位点I来源于与所
10.根据权利要求7所述的环状RNA，其中，所述第一预设数量的核苷酸选自3-100个核苷酸，优选3-50个核苷酸，更优选3-10个核苷酸；或者
11.根据权利要求1-10任一项所述的环状RNA，其中，所述翻译起始元件包含具有起始编辑区翻译的活性的序列；
12.根据权利要求1-11任一项所述的环状RNA，其中，所述目标多肽为人源蛋白或非人源蛋白；
...【技术特征摘要】
1.一种环状rna，沿5’向3’方向，其包含按如下顺序排列的元件：
2.根据权利要求1所述的环状rna，其中，所述环状rna的编码元件包括编码区1，和如下(i)-(ii)组成的组中的至少一种：
3.根据权利要求1所述的环状rna，其中，所述环状rna的编码元件包括编码区1和至少一个编码区4，并且，任意一个编码区的5’端连接有翻译起始元件。
4.根据权利要求2所述的环状rna，其中，所述环状rna由重组核酸分子制备，
5.根据权利要求4所述的环状rna，其中，所述重组核酸分子包括如下(i)-(ii)中一种或两种的元件：
6.根据权利要求3所述的环状rna，其中，所述环状rna由重组核酸分子制备，
7.根据权利要求4-6任一项所述的环状rna，其中，
8.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：仇宗浩，赵阳，左炽健，
申请(专利权)人：苏州科锐迈德生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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