【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种阳离子脂质及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米颗粒组合物在细胞转染中的应用，以及一种利用该阳离子脂质及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米颗粒组合物提升细胞(特别是干细胞或免疫细胞)转染效率的方法，在此基础之上，核酸脂质纳米颗粒组合物在免疫细胞中的高效转染能够有效刺激免疫细胞扩增。
技术介绍
1、转染是一种能够将外源基因导入真核细胞内的专业技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常用工具，广泛应用在基因功能研究、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学实验中。根据导入的核酸存在于宿主细胞内时间的长短，转染可以分为瞬时转染(瞬转)和稳定转染(稳转)；根据转染方式，转染可以大致分为物理转染、化学转染和生物转染。上述转染方式各有优缺点，因此，根据需求选择简单、合适、安全性高且高效的转染方法很重要。
2、然而，对于难以高效转染的干细胞和免疫细胞而言，目前市面上的转染试剂(如lipo 2000，如附图1所示，其将egfp转染到t细胞中的转染效率不足5％)以及商业化的阳离子脂质所形成的脂质纳米颗粒组合物(如alc0315和dlin-mc3-dma，如附图1所示，两者将egfp转染进t细胞后其表达百分比均在20％以下)难以高效地将核酸递送至干细胞和免疫细胞内且有效地提升核酸表达，并且转染试剂的细胞毒性也是影响转染的重要因素。而物理转染法中的电穿孔法需要特殊设备，针对不同细胞需要优化不同条件，且细胞致死率较高。生物转染法中的病毒转染法需要用到特殊的病毒，操作复杂
3、因此，有必要开发出一种提升细胞(特别是难转染的干细胞和免疫细胞)转染效率的方法，使外源基因(如核酸)能够在细胞中高效转染且对细胞无毒性或低毒性。
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、本专利技术旨在提供一种阳离子脂质及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米颗粒组合物在细胞转染中的应用以及一种利用该阳离子脂质及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米颗粒组合物提升细胞(特别是干细胞和免疫细胞)转染效率的方法，该方法转染效率高，细胞毒性小，操作简单，条件温和，在此基础上，核酸脂质纳米颗粒组合物在免疫细胞中的高效转染能够有效刺激免疫细胞扩增，在扩增免疫细胞的过程中不引入外源细胞因子及额外的如k562细胞等饲养细胞，生物安全性更高，且降低了免疫细胞的培养成本。
3、用于解决问题的方案
4、为了解决这一问题，申请人使用一种包含阳离子脂质的核酸脂质纳米颗粒组合物对干细胞或免疫细胞进行转染，实验结果表明本专利技术的核酸脂质纳米颗粒组合物能够有效地将核酸带入到目前转染试剂难以高效转染的干细胞和免疫细胞中。
5、第一方面，本专利技术提供了一种阳离子脂质或包含其的脂质载体或核酸脂质纳米颗粒组合物在细胞(优选干细胞和/或免疫细胞)转染中的应用，所述阳离子脂质为式(i)化合物或式(ii)化合物中的一种或多种的组合，或者其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物；
6、
7、在式(i)化合物中：
8、r1和r2各自独立地为c1-24烷基或c2-24烯基；优选地，r1和r2各自独立地为c4-24烷基或c4-24烯基；更优选地，r1和r2各自独立地为c4-24支链烷基或c4-24支链烯基；进一步优选地，r1和r2各自独立地为c10-24支链烷基或c10-24支链烯基；最优选地，r1和r2各自独立地为c10-24支链烷基；
9、a1和a2各自独立地为-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(＝o)-、-s-s-、-c(＝o)s-、-sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、-c(ra)oh-、-nhc(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-、-nrac(＝o)o-或-o(c＝o)o-或不存在；优选地，a1和a2各自独立地为-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(＝o)-、-s-s-、-c(＝o)s-、-sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、-c(ra)oh-、-nhc(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-、-nrac(＝o)o-或-o(c＝o)o-；更优选地，a1和a2各自独立地为-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-nrac(＝o)-或-c(＝o)nra-；进一步优选地，a1和a2各自独立地为-o(c＝o)-或-(c＝o)o-；
10、b1和b2各自独立地为c1-12亚烷基或c2-12亚烯基；优选地，b1和b2各自独立地为c2-9亚烷基或c2-9亚烯基；更优选地，b1和b2各自独立地为c2-9亚烷基；
11、b3为c1-6亚烷基或不存在；优选地，b3为c1-4亚烷基；更优选地，b3为亚丙基；
12、x为任选地通过与b3连接的-nr3r4或-crar5r6；优选地，x为-nr3r4或-chr5r6；更优选地，x为-nr3r4；
13、r3和r4各自独立地为氢或任选地被至少一个羟基或2-(甲氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基取代的c1-6烷基，或者，r3和r4与其所连接的n共同形成任选地被至少一个c1-6烷基取代的下列基团之一：3-10元杂环烷基或5-10元杂芳基；优选地，r3和r4各自独立地为氢或c1-6烷基；更优选地，r3和r4各自独立地为氢或c1-4烷基；更优选地，r3和r4各自独立地为c1-4烷基；
14、r5和r6与其所连接的cra共同形成任选地被至少一个c1-6烷基取代的下列基团之一：3-10元含氮杂环烷基或5-10元含氮杂芳基；
15、每一个ra各自独立地为氢或c1-6烷基；优选地，ra各自独立地为氢；
16、所述杂环烷基和杂芳基各自独立地具有1至3个杂原子或杂原子团，每一个所述杂原子或杂原子团各自独立地为n、nh、o、s、s(＝o)或s(＝o)2；所述含氮杂环烷基和含氮杂芳基各自独立地具有1至3个杂原子或杂原子团，每一个所述杂原子或杂原子团各自独立地为n、nh、o、s、s(＝o)或s(＝o)2，且至少一个所述杂原子或杂原子团为n或nh；
17、优选地，x为下列基团中的任一种：
18、
19、更优选地，x为下列基团中的任一种：
20、
21、进一步优选地，x为
22、
23、在式(ii)化合物中：
24、a1、a2、a3、a4和a5各自独立地为-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)-、-s-s-、-c(＝o)s-、-sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、-nraoc(＝o)-、-oc(＝o)nra-或-nraoc(＝o)nra-；优选地，a1、a2、a3、a4和a5各自独立地为-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-nrac本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种阳离子脂质或包含其的脂质载体或核酸脂质纳米颗粒组合物在干细胞或免疫细胞转染中的应用，其特征在于，所述阳离子脂质为式(I)化合物或式(II)化合物中的一种或多种的组合，或者其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物，
2.一种提升细胞转染效率的方法，所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脂质载体与所述核酸的质量比为(1～50):1，优选(1～30):1；和/或
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述核酸脂质纳米颗粒组合物的粒径为40nm-500nm，优选为60nm-300nm；
5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸为DNA、siRNA、mRNA、dsRNA、反义核酸、微RNA、反义微RNA、antagomir、微RNA抑制剂、微RNA激活剂和免疫刺激性核酸中的一种或多种的组合。
6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于，所述干细胞为脂肪干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、生殖干细胞、
7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，所述脂质载体还包含磷脂、甾醇和两亲性脂质；
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述磷脂包括DOPE、DSPC、DPPC、DOPC、DPPG、POPC、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SOPE中的至少一种；所述甾醇为胆固醇、谷甾醇、菜油甾醇、芸苔甾醇和光甾醇中的至少一种；所述两亲性脂质包括PEG-DMG、PEG-c-DMG、PEG-C14、PEG-C18、ALC0159、PEG-c-DMA、PEG-DSPE、PEG-PE、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、PEG-DPG、PEG-s-DMG、DAA、PEG-c-DOMG和GalNAc-PEG-DSG中的至少一种。
9.根据权利要求2-8任一项所述的方法，其特征在于，所述孵育的条件为：温度为30℃-40℃，优选37℃；在孵育培养基或缓冲液中孵育3min-72h；
10.根据权利要求2-9任一项所述的方法，其特征在于，所述干细胞或免疫细胞的接种密度为5×103～2×107个/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种阳离子脂质或包含其的脂质载体或核酸脂质纳米颗粒组合物在干细胞或免疫细胞转染中的应用，其特征在于，所述阳离子脂质为式(i)化合物或式(ii)化合物中的一种或多种的组合，或者其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物，
2.一种提升细胞转染效率的方法，所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脂质载体与所述核酸的质量比为(1～50):1，优选(1～30):1；和/或
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述核酸脂质纳米颗粒组合物的粒径为40nm-500nm，优选为60nm-300nm；
5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸为dna、sirna、mrna、dsrna、反义核酸、微rna、反义微rna、antagomir、微rna抑制剂、微rna激活剂和免疫刺激性核酸中的一种或多种的组合。
6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于，所述干细胞为脂肪干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、生殖干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞和成肌细胞等中的一种或多种的组合；所述免疫细胞为t淋巴细胞、b淋...
【专利技术属性】
技术研发人员：高银佳，黄珂，黄龙岳，葛童童，赵亮，孙振华，
申请(专利权)人：苏州科锐迈德生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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