用于编辑目标核酸的组合物及编辑目标核酸的方法技术

本公开涉及用于编辑目标核酸的组合物及编辑目标核酸的方法，具体涉及一种用于编辑目标核酸的组合物、试剂盒及用途，编辑目标核酸的方法，预防或治疗疾病的方法。本公开提供的用于编辑目标核酸的组合物，利用环状mRNA以及环状或线状的gRNA向细胞内递送编码目标核酸的CRISPR相关蛋白以及gRNA分子，避免了以质粒、病毒等作为载体递送CRISPR相关蛋白、gRNA时存在的向细胞基因组内整合的安全隐患，具有使用安全性高、基因编辑效率高的优势，在基因编辑、疾病治疗等生物医学领域具有广阔的应用前景。前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
用于编辑目标核酸的组合物及编辑目标核酸的方法


[0001]本公开属于分子生物学和生物工程
，具体来说，本公开涉及一种用于编辑目标核酸的组合物、试剂盒及用途，编辑目标核酸的方法，预防或治疗疾病的方法。

技术介绍

[0002]成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR，Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)[1]来源于适应性抗病毒免疫系统，存在于大多数古细菌和许多细菌中。在细菌和古生菌中CRISPR系统整合侵入宿主的噬菌体或者质粒DNA的片段到CRISPR位点，然后通过相应的CRISPR RNAs(crRNAs)引导Cas核酸内切酶损坏外源DNA序列，抵抗病毒或者噬菌体的入侵。自1987年Ishino等人在大肠杆菌(E.coli)基因组中发现一连串短的空间间隔重复序列以来[2]，已被成功运用到多个物种的基因编辑中，在基因编辑、基因筛选、基因表达调控、成像以及核酸检测和诊断等领域获得了广泛的应用。
[0003]目前已发现的CRISPR/Cas系统可以分为两类(第1类和第2类)，并进一步分为六种类型(I型～
Ⅵ
型)。其中，第1类系统包括I型、III型和IV型，第2类系统包括II型、V型以及VI型。以主要的第2类、II型CRISPR
‑
Cas9系统为例，细菌对外来病毒的入侵分为3步：(1)CRISPR获取间隔序列。病毒入侵细菌，Cas1和Cas2蛋白复合物靶向并将病毒DNA切割成短片段，称为原型间隔序列(protospacer)，插入到CRISPR重复序列之间，作为“记忆”储存。(2)CRISPR基因座的表达。同种病毒再次入侵时，protospacer序列被转录成前体pre
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crRNA(CRISPR RNAs)，在Cas蛋白和tracrRNA(trans
‑
activating crRNA)作用下剪切成小的RNA，即成熟的crRNA。(3)CRISPR/Cas系统切割外源DNA。crRNA与tracrRNA形成一种双链二级结构，与Cas9形成crRNA
‑
tracrRNA
‑
Cas蛋白三聚体，识别紧随protospacer序列后的PAM(protospacer adjacent motif)序列，crRNA能与外源核酸的靶标序列互补配对，引导Cas蛋白的核酸酶结构域在特定位置对外源核酸进行切割。靶标序列在此阶段解开并被Cas9蛋白的核酸酶结构域(RuvC和HNH)切割，在目标序列中留下双链断裂，并激活细胞的非同源末端连接(non
‑
homologous end joining，NHEJ)或同源重组(homologous recombination，HR)两种修复机制，从而实现基因的敲除、插入或修饰[3
‑
4]。正是通过这些过程，一些细菌才能在感染期间将病毒基因组整合到它们自己的基因组中(即CRISPR阵列)，从而在未来的感染过程中产生更有效的免疫反应。
[0004]CRISPR/Cas9系统结构简单，仅由crRNA、tracrRNA和Cas9三种成分组成。根据tracrRNA与crRNA的结构特性，科学家们将tracrRNA和crRNA组合为一条嵌合的向导RNA(guide RNA，gRNA)，使得CRISPR/Cas9系统进一步简化为只有gRNA和Cas9这2种组分的系统。通过设计一段可与靶基因区域PAM序列上游的靶标序列互补配对的向导序列，就可以对宿主细胞内任意基因进行编辑。并且，随着CRISPR/Cas12a(旧称CRISPR/Cpf1)、CRISPR/Cas13a、CRISPR/Cas13b等新型基因编辑工具的相继发现，进一步扩展了CRISPR/Cas系统的生物学功能。
[0005]CRISPR/Cas系统作为一种功能强大、应用便捷的基因编辑工具在生命医学领域中
获得快速发展。然而，目前CRISPR/Cas系统中Cas蛋白、gRNA在向细胞组织内的递送时主要依赖质粒、病毒等载体，一方面受质粒、病毒等载体表达效率的影响，导致CRISPR/Cas系统在细胞内的基因编辑效率不高；另外质粒、病毒等载体存在向宿主细胞的基因组内整合的风险，增加了CRISPR/Cas系统在体内应用的安全隐患。
[0006]引用文献：
[0007][1]Jansen R,Embden JDA,Gaastra W,et al.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.Mol Microbiol.2002；43:1565
–
1575.
[0008][2]Ishino Y,Shinagawa H,Makino K,et al.Nucleotide sequence of the iap gene,responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli,and identification of the gene product.J Bacteriol.1987；169:5429
–
5433.
[0009][3]Barrangou R,Marraffni LA.CRISPR
‑
Cas systems:prokaryotes upgrade to adaptive immunity.Mol Cell,2014,54(2):234
‑
244.
[0010][4]Wiedenheft B,Sternberg SH,Doudna JA.RNA
‑
guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.Nature,2012,482(7385):331
‑
338.

技术实现思路

[0011]专利技术要解决的问题
[0012]鉴于现有技术中存在的问题，例如，通过载体递送Cas蛋白、gRNA时存在向宿主细胞的基因组内整合，提高了CRISPR/Cas系统在体内应用的安全隐患等缺陷。为此，本公开提供了用于编辑目标核酸的组合物，利用环状mRNA以及环状或线状的gRNA向细胞内递送编码目标核酸的CRISPR相关蛋白以及gRNA分子，避免了以质粒、病毒等作为载体时存在的向细胞基因组内整合的安全隐患，具有使用安全性高、基因编辑效率高的优势，在基因编辑、疾病治疗等生物医学领域具有广阔的应用前景。
[0013]用于解决问题的方案
[0014](1)一种用于编辑目标核酸的组合物，其包括环状mRNA和gRNA；其中，所述环状mRNA包含编码CRISPR相关蛋白的编码元件，和与所述编码元件可操作地连接的翻译起始元件；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于编辑目标核酸的组合物，其包括环状mRNA和gRNA；其中，所述环状mRNA包含编码CRISPR相关蛋白的编码元件，和与所述编码元件可操作地连接的翻译起始元件；所述gRNA选自环状RNA或线状RNA，其包含用于结合所述CRISPR相关蛋白的第一序列，和用于结合所述目标核酸中靶序列的第二序列。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，沿5
’
向3
’
方向，所述环状mRNA包含如下所示排列次序的元件：翻译起始元件，以及，编码元件；优选地，所述翻译起始元件由翻译起始元件截断片段I与翻译起始元件截断片段II沿5
’
向3
’
方向连接形成。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述翻译起始元件包含如下所示的一种或两种以上的具有翻译起始活性的序列：IRES序列、5
’
UTR序列、Kozak序列、包含m6A修饰的序列、核糖体18S rRNA的互补序列；优选地，所述翻译起始元件包含IRES序列。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的组合物，其中，所述环状mRNA由环化前体RNA发生自剪切反应后环化形成；可选地，所述环化前体RNA中包含外显子元件或不包含外显子元件。5.根据权利要求4所述的组合物，其中，沿5
’
向3
’
方向，所述环化前体RNA包含如下(i)
‑
(v)中任一项所示排列次序的元件：(i)5
’
同源臂、内含子片段II、第二外显子、5
’
间隔区、翻译起始元件、编码元件、3
’
间隔区、第一外显子、内含子片段I和3
’
同源臂；(ii)5
’
同源臂、内含子片段II、第二外显子、翻译起始元件、编码元件、第一外显子、内含子片段I和3
’
同源臂；(iii)内含子片段II，编码元件截断片段II，翻译起始元件，编码元件截断片段I，内含子片段I；(iv)内含子片段III，编码元件截断片段IV，翻译起始元件，编码元件截断片段III，内含子片段IV；(v)内含子片段II，翻译起始元件截断片段II，编码元件，翻译起始元件截断片段I，内含子片段I；优选地，沿5
’
向3
’
方向，所述环化前体RNA包含如(v)所示排列次序的元件。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的组合物，其中，所述CRISPR相关蛋白选自如下任意一种的Cas蛋白或Cas蛋白的功能变体：Ca...

【专利技术属性】
技术研发人员：仇宗浩，侯强波，杜雅冉，朱佳凤，周晨，孙振华，
申请(专利权)人：苏州科锐迈德生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：