用于产生核酸多样性的方法和系统技术方案

提供了一种方法，其包括：在重组细胞中表达重组易错逆转录酶(RT)和包含靶序列的重组间隔子RNA；制备与所述重组细胞中的DNA序列同源的诱变cDNA多核苷酸；在重组细胞中表达重组的重组工程系统；以及在重组细胞中将诱变的cDNA与同源DNA序列重组。还提供了重组细胞，其包含重组易错逆转录酶(RT)、包含靶序列的重组间隔子RNA以及重组的重组工程系统的重组编码序列。序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生核酸多样性的方法和系统


[0001]本专利技术涉及用于在重组细胞中体内产生靶向核酸多样性的方法。本专利技术还涉及用于产生靶向核酸多样性的重组细胞系统及其用途。

技术介绍

[0002]定向进化模拟天然选择，目的是产生目标的核酸和/或蛋白质的有用变体。突变可以随机地，通过诱变剂，或以靶向方式在目的基因中引入，任选地随后选择目的性状。当目标是进化特定基因或基因集合时，靶向多样性产生可用于限制选择目的基因之外的突变的机会。与单纯通过随机诱变的方法相比，定向诱变还可以确保评估更多的靶基因序列。靶向方法的仔细设计还可以确保有效探索序列空间，例如通过探索特定的目标残基处的序列变异或通过避免无义突变。这种定向诱变典型地在体外通过各种分子生物学技术，包括易错PCR，或通过合理设计和构建质粒文库进行。然而，这些步骤可能较麻烦，尤其是进行多次进化循环时。以靶向方式直接在体内使序列多样化的能力是定向进化的长期目标，也是朝向连续进化设置的步骤，其中多样化和选择都可以在体内发生。
[0003]自然界中存在有产生靶向多样性的实例。抗体多样性的产生是人类适应性免疫系统的关键特征。在细菌中，产生多样性的逆转录元件(retroelement，DGR)能够在噬菌体蛋白和细菌蛋白中引入受控的序列多样性，所述噬菌体蛋白和细菌蛋白参与与其环境的相互作用。最初在博德特氏菌噬菌体BPP
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1[1]中表征的DGR，现在广泛存在于各种噬菌体、细菌和古细菌中[2]。在DGR重组中，基因组内的可变区将被在过程中由近重复模板区产生的DNA片段覆盖，该过程涉及模板的转录、易错逆转录和重组。易错逆转录确保在可变区引入基因多样性。迄今在表征的DGR系统中，两种DGR蛋白对于该过程是必需的，逆转录酶主要亚基(RT)和辅助亚基(Avd)，其共同形成活性逆转录酶复合物([1]；[3]；[4]；[5]；[6]；[7])。通过生物信息学分析，在一些DGR中还鉴定了由HRDC(解旋酶和RNA酶D C
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端)结构域组成的替代辅助基因[3]。大多数可变区已在模板区和两个DGR蛋白的几千碱基对(kb)内被鉴定([3]；[2])。定义诱变窗的模板区被嵌入Avd和RT编码序列内，位于从AVD基因的末端到RT基因的起始的转录RNA片段内，称为间隔子RNA，DGR RNA或DGR间隔子RNA。DGR RT复合物在自引发过程中从mRNA无疑地产生cDNA拷贝[6]。DGR RT中的特定偏差掺入随机的核苷酸代替腺嘌呤。然后，用该cDNA拷贝覆盖可变区，从而获得基因中的A至N突变。由于A残基在序列中的位置，总体蛋白质结构(典型地为C型凝集素折叠)典型地会被保留，而结合沟中的关键残基改变([1]；[8])。就博德特氏菌(Bordetella)而言，DGR重组可以引入10
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个独特氨基酸序列的多样性。然而，密码子中A核苷酸的位置(即仅在密码子的第一和第二位置)否定了发生无义突变的可能性([1]；[8])。DGR系统已被用来将诱变重定向至选定的目标序列[9]，然而这仅通过在其天然宿主博德特氏菌属菌株中使用DGR来实现，且保持将识别序列放置在紧邻所需诱变窗口(IMH序列)的要求，这极大地限制了其作为遗传工具的可能应用。
[0004]虽然DGR尚未在定向进化设置中得到利用，但已经提出了大量的人工定向诱变策略，且近年来数量已经成倍增加，表明在该领域中迫切需要改进([10]；[11])。事实上，精准
诱变编码DNA的特定片段的能力是扩展到生物技术的所有子领域(从酶工程、疫苗开发到诊断开发)的应用的基石。最近由等[10]进行了综述，定向诱变技术可以根据几个参数分类，包括诱变速率和跨度，以及其中产生变体序列文库的条件。
[0005]迄今为止所开发的十几种定向诱变技术中，只有少数定向诱变技术可以进行体内诱变。
[0006]在EvolvR系统中，D10A Cas9切口酶(Cas9n1)用于将融合的易错切口翻译DNA聚合酶定位到基因组的所需区域(Halperin et al.2018)。Cas9n1在一条链上切口，产生3
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端，其可通过融合DNA聚合酶延伸，然后修复[13]。这种再聚合会导致核苷酸错误掺入，且可导致Cas9切口位点上游的DNA突变率峰值增加108倍，每代每102个核苷酸约有1个突变[13]。通过改变融合的聚合酶，可以调节EvolvR系统以改变突变率以及增加或减少突变优先发生的窗口大小。EvolvR的局限性是其容易引入无义突变。大肠杆菌(E.coli)总体突变率也受诱变聚合酶融合的存在的影响，其增加了120倍
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555倍，且提高了在目的区域外选择突变的风险。
[0007]T7
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DIVA系统依赖于诱变的T7 RNA聚合酶
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碱基脱氨酶融合体(BD
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T7RNAP)。诱变窗口由T7启动子在上游划定，且由dCas9靶向划定下游，作为BD
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T7RNAP延伸的“路障”[14]。对T7启动子的要求意味着，在其天然基因组环境中对靶序列诱变是不可行的，且碱基脱氨酶突变谱限于单个可能的核苷酸取代(例如C>T)，限制了其产生用于探索蛋白质序列多样性的定制诱变的能力。
[0008]由Simon等开发的系统依赖工程化的逆转录子(另一种细菌逆转录因子，与DGR无关)。诱变活性由将逆转录子与诱变T7 RNA聚合酶偶联产生[15]。它们在目标区域获得的突变率比背景细胞突变率高190倍(每代高达6.3
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7)，诱变窗口仅限于31bp(因此仅覆盖蛋白质编码序列中最多10个氨基酸)。这限制了其生成定制诱变以探索蛋白质序列多样性的能力。
[0009]总之，这些方法的诱变速率低。此外，迄今为止可用的技术都不能控制突变的碱基的确切位置，也不能提供确保引入的突变不会产生终止密码子的机制。因此，非常需要开发用于产生序列多样性的另外其他的方法、系统、组合物和制造品以及利用其的应用。本专利技术在某些实施方案中满足这些和其他需要。
[0010]专利技术简述
[0011]本专利技术提供了基于使用诱变逆转录酶的体内靶向多样性产生策略，产生与所需靶序列同源的诱变cDNA寡核苷酸，然后通过寡核苷酸重组工程将其重组到基因组或重组载体上任何位置的靶区域内(图1)。该策略在模型实验室生物体大肠杆菌中的功能性实施证实了能够在定向进化中具有多种应用。在某些实施方案中，本专利技术使得在更精确调节的基因组区域中，在其天然基因组环境中的任何靶的体内诱变潜力增加几个数量级，其全部由紧凑的质粒携带的系统编码。
[0012]该方法第一次依赖于本文首次公开的两个关键成果：1)基于功能性质粒的诱变逆转录元件平台(或系统)在大肠杆菌中的表达(由天然DGR激发)；以及2)该系统与寡核苷酸重组工程的结合，能够在基因组或重组载体上的任何目标区域中掺入突变(图1)。该系统被命名为DGR重组工程或DGRec。
[0013]这两个组合元件代表了定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.产生靶向核酸多样性的方法，其包括在重组细胞中表达重组易错逆转录酶(RT)和包含靶序列的重组间隔子RNA；制备与所述重组细胞中的DNA序列同源的诱变cDNA多核苷酸；在重组细胞中表达重组的重组工程系统；以及在重组细胞中将诱变的cDNA与同源DNA序列重组。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组易错逆转录酶(RT)包含重组DGR逆转录酶主亚基(RT)和重组DGR辅助亚基(Avd)，且所述重组间隔子RNA包含含有靶序列的重组DGR间隔子RNA。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述重组易错逆转录酶(RT)包含基序I/LGXXXSQ(SEQ ID NO:2)。4.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述重组易错RT是源自非诱变逆转录酶的工程化重组易错RT；优选地，所述重组易错RT是突变体Ec86逆转录酶，其包含用基序I/LGXXXSQ(SEQ ID NO:2)替换基序QGXXXSP(SEQ ID NO:1)。5.根据权利要求2或3的方法，其中所述重组DGR RT、所述重组DGR Avd和所述重组DGR间隔子RNA来自博德特氏菌噬菌体BPP
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1。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中，所述重组易错RT具有腺嘌呤诱变活性；优选地，其中所述重组易错RT是包含在腺嘌呤位置降低其错误率的突变的DGR RT，所述突变选自下组：R74A和I181N，所述位置由与SEQ ID NO:4的比对确定。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述重组的重组工程系统不同于DGR逆向工程。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中所述重组的重组工程系统是介导寡聚物重组工程的重组单链退火蛋白；优选选自下组：噬菌体λ的Redβ蛋白、RecT、PapRecT和CspRecT。9.根据权利要求2、3和5
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8中任一项所述的方法，其中所述重组DGR RT、重组DGR Avd、重组DGR间隔子RNA和重组的重组工程系统都由一种或多种重组质粒一起表达，所述重组质粒包含重组DGR RT、重组DGR Avd、重组DGR间隔子RNA和重组的重组工程系统的编码序列。10.根据权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：