萤光素酶联免疫吸附测定制造技术

本发明专利技术涉及一种融合蛋白，其包含：

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】萤光素酶联免疫吸附测定


[0001]本专利技术涉及一种用于检测样品中的免疫球蛋白的方法，用于该方法的融合蛋白，以及尤其可以用于该方法中的具有改进特性的突变萤光素酶。

技术介绍

[0002]为了在受试者中测试过去或现在对感染的适应性免疫应答的证据，必须使用快速诊断测试或基于实验室的免疫测定形式进行针对传染剂或过敏原的血清学测定。
[0003]市场上有范围广泛的血清学测试。例如，基于实验室的免疫测定可以是酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)、化学发光免疫测定(CLIA)或电致发光测定(ECL)。
[0004]然而，无论是任何用于血清学测试的方案，它都必须符合安全、质量和性能标准(关于分析的和临床的灵敏度和特异性)。
[0005]市场上用于检测和/或量化指示过去或现在感染的免疫球蛋白的大多数标准血清学测试都是敏感的，但它们需要相对大量的血浆(这在测试幼儿时可能是有问题的)，并且还受到成本和需要特定仪器来分析测试结果的限制。因此，需要进一步开发以提高血清学测试的灵敏度，同时显著减少所需的样品体积和成本，同时不牺牲测定的稳健性、重现性和准确性。

技术实现思路

[0006]现在，申请人已发现通过将骆驼科动物重链抗体(VHH)的可变结构域与源自Oplophorus gracilirostris萤光素酶催化结构域的萤光素酶融合，在进行特异性免疫球蛋白的检测时可以减少样品体积，同时保持所需的特异性和灵敏度，动态范围增大并且测定时间更短。本申请的血清学测定设计可以用于快速诊断测试。因此，能够设计用于检测和/量化对任何感兴趣的传染病以及过敏或自身免疫性疾病具有特异性的免疫球蛋白的测定。
[0007]因此，本专利技术的一个主题是一种融合蛋白，其包含：
[0008]‑
N
‑
末端结构域，其包含作为骆驼科动物重链抗体(VHH)的可变结构域或单链可变片段(scFV)并且针对免疫球蛋白的抗体
[0009]和
[0010]‑
C
‑
末端结构域，其包含具有萤光素酶活性的多肽：
[0011]‑
具有氨基酸序列SEQ ID NO：1或
[0012]‑
与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有至少80％的氨基酸序列同一性。
[0013]申请人还发现，使用NanoKAZ萤光素酶的特定突变体，其血清学测试的结果愈发改善。
[0014]因此，本专利技术还涉及一种萤光素酶，其与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有至少80％的氨基酸序列同一性并且包含至少一个选自以下的氨基酸替换：
[0015]‑
将在对应于SEQ ID NO：1第18位的位置的酪氨酸(Y)替换为精氨酸(R)，
[0016]‑
将在对应于SEQ ID NO：1第48位的位置的亮氨酸(L)替换为赖氨酸(K)，
[0017]‑
将在对应于SEQ ID NO：1第56位的位置的异亮氨酸(I)替换为丙氨酸(A)，
[0018]‑
将在对应于SEQ ID NO：1第116位的位置的酪氨酸(Y)替换为苯丙氨酸(F)，
[0019]‑
将在对应于SEQ ID NO：1第134位的位置的色氨酸(W)替换为选自苏氨酸(T)和谷氨酸(E)的氨基酸，
[0020]‑
将在对应于SEQ ID NO：1第163位的位置的色氨酸(W)替换为选自苏氨酸(T)和谷氨酸(E)的氨基酸，
[0021]和
[0022]‑
将在对应于SEQ ID NO：1第166位的位置的半胱氨酸(C)替换为丝氨酸(S)。
具体实施方式
[0023]萤光素酶突变体
[0024]如本文所用，“萤光素酶”是指产生生物发光的一类氧化酶。生物发光是在涉及通过酶氧化底物的生化反应中产生的光的发射。
[0025]萤光素酶通常存在于低等生物体中，如细菌、真菌、昆虫、鞭毛藻、放射虫、刺胞动物、甲壳类动物、水母和头足类动物。在这些不同的萤光素酶中，来自深海虾Oplophorus的萤光素酶具有有前景的特性(Shimomura O,Masugi T,Johnson FH,Haneda Y.,Properties and reaction mechanism of the bioluminescence system of the deep
‑
sea shrimp Oplophorus gracilirostris.Biochemistry.1978年3月21日；17(6)：994
‑
8)。然而，这种异二聚体结构的具有萤光素酶活性的19kDa亚基(KAZ)没有保留天然酶的许多期望的特征，因为它在没有调节亚基的情况下不稳定并且表达不佳。已通过KAZ序列中的三个氨基酸替换V44I、A54I和Y138I(eKAZ)使得对天然底物腔肠素的活性增加了七倍(Inouye S,Sato J,Sahara
‑
Miura Y,Yoshida S,Hosoya T.Luminescence enhancement of the catalytic 19kDa protein(KAZ)of Oplophorus luciferase by three amino acid substitutions.Biochem Biophys Res Commun.2014；445(1)：157
‑
162.)。
[0026]已通过以下的蛋白质表面疏水氨基酸突变为亲水残基而优化了酶的折叠：A4E、F68D、L72Q、M75K、P115E、和/或N166R。
[0027]然后，Hall等人已设计了一种源自Oplophorus萤光素酶的19kDa亚基的萤光素酶，其具有改进的稳定性，称为nanoLuc、NLuc以及nanoKAZ，具有以下突变：A4E、Q11R、Q18L、L27V、A33N、K43R、V44I、A54I、F68D、L72Q、M75K、I90V、P115E、Q124K、Y138I、和N166R(Hall MP,Unch J,Binkowski BF,Valley MP,Butler BL,Wood MG,Otto P,Zimmerman K,Vidugiris G,Machleidt T,Robers MB,Benink HA,Eggers CT,Slater MR,Meisenheimer PL,Klaubert DH,Fan F,Encell LP,Wood KV.Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.ACS Chem Biol.2012年11月16日；7(11)：1848
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57)。
[0028]然而，nanoKAZ萤光素酶的特本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种融合蛋白，其包含：
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N
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末端结构域，其包含作为骆驼科动物重链抗体(VHH)的可变结构域或单链可变片段(scFV)并且针对免疫球蛋白的抗体和
‑
C
‑
末端结构域，其包含具有萤光素酶活性的多肽：
‑
具有氨基酸序列SEQ ID NO：1或
‑
与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有至少80％的氨基酸序列同一性。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述具有萤光素酶活性的多肽具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、和SEQ ID NO：17。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述VHH针对免疫球蛋白的恒定片段(Fc)。4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体是VHH。5.根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白是针对过敏原的IgE。6.根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白是针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2的蛋白N或S的IgM或IgG。7.一种试剂盒，其包含：
‑
根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，和
‑
具有萤光素酶活性的多肽的底物。8.权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白用于检测和/或量化样品中的免疫球蛋白的用途。9.一种用于检测样品中免疫球蛋白的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使样品与权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白接触，(b)加入具有萤光素酶活性的多肽的底物，(c)检测发光。10.一种用于量化样品中免疫球蛋白的水平的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使样品与权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白接触，(b)加入具有萤光素酶活性的多肽的底物，(c)量化发光。11.一种用于量化样品中每个亲和间隔的免疫球蛋白水平以评估多克隆免疫球蛋白混合物的亲和范围的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在游离抗原的稀释系列的存在下，使样品与抗原接触，(b)使样品与权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白接触，(c)加入具有萤光素...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：