拉沙疫苗制造技术

本发明专利技术涉及表达拉沙病毒多肽的重组麻疹病毒，尤其涉及由麻疹病毒和/或含有拉沙病毒蛋白的病毒样颗粒(VLP)表达的免疫原性LASV颗粒。这些颗粒是在施用后能够在宿主中复制的重组感染性颗粒。本发明专利技术提供了产生这些重组感染性颗粒的手段，特别是核酸构建体、载体、细胞和拯救系统。本发明专利技术还涉及这些重组感染性颗粒，特别是以组合物的形式，更具体地在疫苗制剂中，用于治疗或预防拉沙病毒感染的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】拉沙疫苗
本申请总体上涉及重组基因构建体，其包含重组麻疹病毒并表达至少一种拉沙病毒(Lassavirus)多肽、蛋白质、抗原或其抗原性片段。本申请还涉及基因构建体或病毒的用途，更具体地，涉及基因构建体或病毒在诱导针对拉沙病毒(LASV)和/或麻疹病毒(MV或MeV)的保护中的用途。更特别地，本专利技术的手段致力于重组核酸构建体，该重组核酸构建体允许表达以下LASV的多肽中的至少一种或其截短形式或其抗原性片段：核蛋白(NP)、糖蛋白前体(GPC)、锌结合蛋白(Z)或天然NP蛋白的突变形式(突变的NP或mNP)，其中NP蛋白的核酸外切酶活性已被降低。本专利技术还涉及一种重组MeV-LASV病毒，其表达至少一种前述LASV多肽、其抗原性片段或其抗原或其截短形式，即NP、mNP、GPC和/或Z。本专利技术还涉及由麻疹病毒表达并包含LASV多肽(尤其是至少GPC多肽或蛋白质，或其抗原性片段)的免疫原性颗粒，和/或至少包含Z多肽或蛋白质或其抗原性片段的感染性病毒样颗粒(VLP)，所述免疫原性颗粒和/或VLP能够引起针对LASV的细胞应答和/或体液应答，特别是T细胞应答，特别是CD4+和/或CD8+T细胞应答。特别地，本专利技术涉及这些基因构建体、重组核酸构建体、表达载体如质粒载体等、重组病毒感染性颗粒(VLP)在诱导宿主内的免疫原性或抗原性应答中的用途。
技术介绍
拉沙病毒(LASV)是沙粒病毒科(Arenaviridaefamily)的一种古老沙粒病毒。LASV是有包膜的、单链的、两段式的双义RNA病毒(ambisenseRNAvirus)。他们的基因组包含两个RNA片段，每个片段编码两种蛋白质，每种意义上的一种，共编码四种病毒蛋白质。较大的片段(约7kb)编码锌结合蛋白Z。Z蛋白调节复制和转录。较大的片段还编码RNA聚合酶L。较小的片段(约3.4kb)编码核蛋白(NP)和糖蛋白前体(GPC)，它们在翻译后被切割成包膜糖蛋白GP1和GP2和稳定的信号肽SSP。这两种糖蛋白介导宿主细胞进入。L聚合酶蛋白内包含沙粒病毒的合成能力。该蛋白质使用病毒RNA模板，该模板包含由NP蛋白和病毒核糖核蛋白包裹的基因组RNA。感染后，病毒被递送到宿主细胞的细胞质中，L聚合酶蛋白从位于每个基因组RNA片段3'末端的基因组启动子启动转录。初级转录导致合成以反基因组方向编码的病毒基因(即NP和L基因)的mRNA。转录终止于基因组区域内茎环结构的远端。然后，L聚合酶移动穿过基因组区域以产生互补的反基因组RNA。该RNA用作合成病毒基因GPC和Z的mRNA以及合成全长基因组RNA的模板。LASV是人类拉沙热(一种严重的出血热)的病因。该病毒的天然贮存库是非洲啮齿动物Mastomysnatalensis。拉沙病毒是从啮齿动物传播给人类的，但该病毒也可能会在人与人之间传播，从而引起局部暴发。每年在西非的流行地区，特别是在几内亚、利比里亚、尼日利亚和塞拉利昂，据报道有100000至300000例患者，有时多达500000例患者患有拉沙热。因此，在这些地区，拉沙热是主要的公共卫生问题。该疾病的严重程度从无症状感染到导致致命性出血热的严重并发症不等。临床体征和症状包括发烧，咳嗽，胸痛，排尿困难，头痛，呕吐，腹泻，咽炎，结膜炎，出血和面部浮肿。LASV感染患者的死亡率很高，在LASV分布的某些地区，死亡率约为10％。幼儿的死亡率高达50％。此外，大约20％的幸存者表现出包括听力障碍在内的长期并发症。因此，拉沙热对这些地区的人口有严重影响，是一个主要的健康问题。最近，拉沙热感染的分布似乎在其他西非国家中蔓延，因为过去十年间在马里，加纳，科特迪瓦和布基纳法索都报告了病例。尽管它于1969年在尼日利亚发现，但目前尚无针对拉沙热的预防或预防性治疗方法。大多数患者接受抗病毒药物利巴韦林治疗。不幸的是，仅在疾病过程的早期给药时，用该药物治疗似乎才最有效，而且还不能完全有效。还应在支持性护理下完成治疗，例如维持血压和氧合作用，保持体液和电解质平衡以及治疗其他任何感染。因此，可能难以有效治疗拉沙热蔓延的西非流行地区的患者。感染是否导致严重疾病或死亡似乎取决于宿主的免疫应答。大多数严重病例包括有缺陷的细胞应答，其中树突状细胞和巨噬细胞大量释放LASV，但未被活化，因此不会产生细胞因子或产生的细胞因子不足。疾病的严重程度，以及病毒在新的地理区域内的扩散和传播，都是需要解决的严重卫生公共事务。在这种情况下，开发预防性疗法(如预防性疫苗)是满足这些人群需求的首要任务。因此，需要一种能够治疗或预防LASV感染(包括预防LASV原发感染的后果，特别是预防拉沙热)的完全有效的治疗方法。预防LASV感染的最有前途的疗法之一是预防接种，但目前尚无此类疫苗。预防将是控制LASV感染和保护当地居民的最简单、最安全的方法。尽管有这样的迫切需求，但尚未有候选疫苗成功地进入临床试验。因此，需要疫苗和用于制备疫苗的产品(例如活性成分)，以及用于生产这些产品和疫苗的方法。候选疫苗在免疫有需要的人时应该安全有效，没有明显的副作用，并诱导产生中和LASV的抗体，以及可能的T细胞，例如T辅助细胞和/或细胞毒性T细胞。换言之，疫苗应引起强烈的细胞应答和/或体液应答。有利地，疫苗应在单次免疫后赋予消除性免疫。为此，需要一种疫苗，该疫苗可在受感染的细胞(特别是宿主的受感染细胞)中在体内产生LASV蛋白和/或LASVVLP并因此提供有效的持久免疫力，特别是该疫苗仅在单个或两个给药步骤后即可诱导终身免疫。另一个需求是促进难以获得医疗中心等服务的人群的疫苗接种。可以引起针对两种病原的免疫作用的候选疫苗可以增强这些人群的整体健康水平。因此，单次疫苗接种可允许针对上述区域中存在的几种病原进行免疫。特别是，为了完全根除麻疹病毒(MeV)，针对MeV和LASV进行免疫的疫苗显然可以保护这些人群免受这两个主要威胁，尤其是在西非。麻疹病毒已于1954年分离出来(Enders,J.F.和T.C.Peebles.1954.Propagationintissueculturesofcytopathogenicagentsfrompatientswithmeasles.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.86:277-286)。麻疹病毒是单股反链病毒目(ordermononegavirales)的成员，即具有非节段负链RNA基因组的病毒。MeV的非节段基因组具有反信使极性(antimessagepolarity)，可导致基因组RNA既不体内或体外翻译，纯化后也不具有感染性。已研究和报道了非节段(-)链RNA病毒的转录和复制以及它们组装成病毒颗粒，特别是在Fieldsvirology(第3版，第1卷，1996，Lippincott–Ravenpublishers–FieldsBN等)中。麻疹病毒的转录和复制不涉及被感染细胞的核，而是像LASV一样在宿主细胞的细胞质中发生。MeV的基因组包含编码六个主要结构蛋白(分别命名为N、P、M、F、H和L)的基因，以及来自P基因(C和V)的另外两个非结构蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核酸构建体，其包含：/n(1)编码麻疹病毒(MeV)的全长反基因组(+)RNA链的cDNA分子；/n(2)编码拉沙病毒(LASV)的至少一种多肽或其抗原性片段的第一异源多核苷酸，所述至少一种多肽选自：核蛋白(NP)、突变核蛋白(mNP)、糖蛋白前体(GPC)和锌结合蛋白(Z)；/n其中，所述第一异源多核苷酸可操作地克隆到插入MeV的反基因组(+)RNA的cDNA内的附加转录单元(ATU)内，特别是插入位于MeV的P基因和M基因之间的ATU内，尤其是插入MeV的P基因和M基因之间的ATU2内。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171221 US 62/609,1551.核酸构建体，其包含：
(1)编码麻疹病毒(MeV)的全长反基因组(+)RNA链的cDNA分子；
(2)编码拉沙病毒(LASV)的至少一种多肽或其抗原性片段的第一异源多核苷酸，所述至少一种多肽选自：核蛋白(NP)、突变核蛋白(mNP)、糖蛋白前体(GPC)和锌结合蛋白(Z)；
其中，所述第一异源多核苷酸可操作地克隆到插入MeV的反基因组(+)RNA的cDNA内的附加转录单元(ATU)内，特别是插入位于MeV的P基因和M基因之间的ATU内，尤其是插入MeV的P基因和M基因之间的ATU2内。


2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体进一步包含第二异源多核苷酸，所述第二异源多核苷酸编码LASV的至少一种多肽或其抗原性片段，所述至少一种多肽选自：GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白，所述第二异源多核苷酸可操作地克隆到另一个ATU中，所述另一个ATU位于不同于第一个克隆的异源多核苷酸的位置，优选在MeV的N基因上游，所述另一个ATU特别地为插入到MeV的N基因的上游的ATU1，所述第二异源多核苷酸编码至少一种特别地与第一异源多核苷酸编码的至少一种多肽不同的多肽或其抗原性片段。


3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体，其中，所述编码GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和/或Z蛋白或其抗原性片段的异源多核苷酸来自LASV菌株Josiah，或衍生自LASV菌株Josiah，特别地，所述异源多核苷酸是由GenbankJ04324.1和/或U73034.2的序列产生或衍生的。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸构建体，其中，所述第一异源多核苷酸和/或第二异源多核苷酸编码mNP蛋白或其抗原性片段，所述mNP蛋白具有突变的核酸外切酶结构域，特别地，编码的mNP蛋白的氨基酸序列在氨基酸残基389和/或392上突变，优选所述突变为在SEQIDNo：3的氨基酸残基389和392上的取代，特别地，编码的mNP蛋白是SEQIDNo：5的序列，特别地，编码mNP蛋白的异源多核苷酸包含SEQIDNo：6。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸构建体，其中，所述编码GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和/或Z蛋白或其抗原性片段的异源多核苷酸具有密码子优化的开放阅读框(ORF)，特别地，所述异源多核苷酸包含以下序列中的至少一个：
-编码GPC蛋白的SEQIDNo：2；和/或
-编码NP蛋白的SEQIDNo：4；和/或
-编码mNP蛋白的SEQIDNo：6；和/或
-编码Z蛋白的SEQIDNo：8。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸构建体，其中，所述异源多核苷酸编码：
-SEQIDNo：1的GPC蛋白或其抗原性片段；和/或
-SEQIDNo：3的NP蛋白或其抗原性片段；和/或
-SEQIDNo：5的mNP蛋白或其抗原性片段；和/或
-SEQIDNo：7的Z蛋白或其抗原性片段。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体从5'末端至3'末端包含以下多核苷酸：
(a)编码MeV的N蛋白的多核苷酸；
(b)编码MeV的P蛋白的多核苷酸；
(c)第一异源多核苷酸，所述第一异源多核苷酸编码选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白的至少一种多肽或其抗原性片段；特别地编码单个多肽，所述单个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段；或编码至少两个多肽，所述两个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段，和NP蛋白或mNP蛋白或其抗原性片段；特别地编码GPC蛋白和mNP蛋白，其中，第一多核苷酸特别地可操作地克隆在ATU，特别是ATU2中；
(d)编码MeV的M蛋白的多核苷酸；
(e)编码MeV的F蛋白的多核苷酸；
(f)编码MeV的H蛋白的多核苷酸；
(g)编码MeV的L蛋白的多核苷酸；
在病毒复制和转录调节因子如MeV前导序列和尾随序列的控制下，所述多核苷酸在核酸构建体内可操作地连接。


8.根据权利要求2至6中任一项所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体从5’末端至3’末端包含以下多核苷酸：
(a)第二异源多核苷酸，所述第二异源多核苷酸编码选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白的至少一种多肽或其抗原性片段；特别地编码Z蛋白或其抗原性片段，其中，所述第二多核苷酸可操作地克隆在位于MeV的N基因上游的ATU中，特别是在ATU1中；
(b)编码MeV的N蛋白的多核苷酸；
(c)编码MeV的P蛋白的多核苷酸；
(d)第一异源多核苷酸，所述第一异源多核苷酸编码选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白的至少一种多肽或其抗原性片段；特别地编码单个多肽，所述单个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段；或编码至少两个多肽，所述两个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段，和NP蛋白或mNP蛋白或其抗原性片段；特别地编码GPC蛋白和mNP蛋白，其中，所述第一多核苷酸特别地可操作地克隆在ATU，特别是ATU2中；
(e)编码MeV的M蛋白的多核苷酸；
(f)编码MeV的F蛋白的多核苷酸；
(g)编码MeV的H蛋白的多核苷酸；
(h)编码MeV的L蛋白的多核苷酸，
在病毒复制和转录调节因子如MeV前导序列和尾随序列的控制下，所述多核苷酸在核酸构建体内可操作地连接。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸构建体，其中，所述第一异源多核苷酸从5’末端至3’末端包含：
(a)编码LASV的NP蛋白或mNP蛋白或其抗原性片段的核酸，特别地，对于NP蛋白，核酸为SEQIDNo：4，或对于mNP蛋白，核酸为SEQIDNo：6；和
(b)编码LASV的GPC蛋白或其抗原性片段的核酸，特别是核酸为SEQIDNo：2；
所述第一异源多核苷酸可操作地克隆在MeV的P基因和M基因之间，特别是在ATU中，尤其是在ATU2中。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸构建体，其中，所述第一异源多核苷酸从5’末端至3’末端包含：
(a)编码mNP蛋白的SEQIDNo：6的核酸；和
(b)编码GPC蛋白的SEQIDNo：2的核酸；
第一异源多核苷酸序列可操作地克隆在MeV的基因P和基因M之间，特别是在ATU中，尤其是在ATU2中。


11.根据权利要求2至10中任一项所述的核酸构建体，其中，所述第二异源多核苷酸编码LASV的Z蛋白或其抗原性片段，所述第一异源多核苷酸编码LASV的GPC蛋白或其抗原性片段，特别地，所述第二异源多核苷酸的序列包含SEQIDNo：8的序列，所述第一异源多核苷酸的序列包含SEQIDNo：2的序列。


12.根据权利要求11所述的核酸构建体，其中，所述第一异源多核苷酸和所述第二异源多核苷酸可操作地克隆在位于MeV的cDNA分子中不同位置的ATU内，特别地，所述第一异源多核苷酸可操作地克隆在ATU2内，所述第二异源...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·马泰奥，S·贝兹，F·坦吉，
申请(专利权)人：巴斯德研究所，法国国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：法国;FR